Dr. Helge Schlupp bloggt in der <a href="https://www.xing.com/communities/groups/information-netzwerk-chemie-7433-1086222/search?query=Biotechnologie%2Bf%C3%BCr%2BChemiker" target="_blank" rel="noopener">GDCh-Xing-Gruppe &uuml;ber Biotechnologiethemen</a> speziell f&uuml;r Chemiker:innen.

Xing-Blog von Dr. Helge Schlupp

Biotechnologie für Chemiker

Gentechnisch modifizierte bzw. ver&auml;nderte Mikroorganismen (GMO bzw. GVO)
Ist bei einer biotechnologischen Fermentation mit anschlie&szlig;endem Downstreamproze&szlig; die Produktausbeute nicht hoch genug, gibt es ein Problem mit der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens, d.h. es rechnet sich nicht. Wenn in Vorversuchen alle m&ouml;glichen denkbaren Parameter zur Erh&ouml;hung der Ausbeute gescheitert sind, wird in der Regel die Gentechnik angewendet. Gentechnik basiert auf den biotechnologischen Methoden und Verfahren, einschlie&szlig;lich der Kenntnisse in der Molekularbiologie und Genetik.
Wenn also Mikroorganismen f&uuml;r einen Einsatzzweck optimiert werden, so handelt es sich hierbei nicht um Neuz&uuml;chtungen, sondern um gentechnisch ver&auml;nderte. Das Wort beinhaltet schon den Ort, an dem etwas ge&auml;ndert wurde, n&auml;mlich an den Genen bzw. am Genom. Nahezu jede Zelle beinhaltet eine DNA, unabh&auml;ngig davon, ob sie in cyclischer Form wie bei Prokaryoten oder in offener Form wie bei Eukaryoten vorliegt. Die daf&uuml;r genutzten Techniken reichen von der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) &uuml;ber die DNA-Sequenzierung und Klonierung bis hin zum Gen-Knockout.
Mit thermostabilen DNA-Polymerasen kann im sogenannten Protein-Engineering ein bestimmtes Proteindesign dargestellt werden. Eine au&szlig;erordentlich thermostabile DNA-Polymerase wurde schon 1969 aus Thermus aquaticus isoliert und tr&auml;gt den Namen Taq-Polymerase. Ein weiteres Beispiel hierzu w&auml;re die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus. Dieser zu den thermophilen Archaeen geh&ouml;rende Mikroorganismus hat ein Temperatur-Optimum von 100 Grad Celsius und beinhaltet als einziger das Element Wolfram.
Bei der DNA-Sequenzierung wird die Nukleotidabfolge in einem DNA-Molek&uuml;l bestimmt. Weil es sich hierbei um das Genom handelt, hat sich ein neuer Begriff etabliert, n&auml;mlich jener der Genomik. Sie ist die analytische Schl&uuml;sselmethode zur DNA-Klonierung. In der Literatur sind mehrere Methoden zur DNA-Sequenzierung zu finden.
Da viele biochemische Prozesse &uuml;ber die Genregulation gesteuert werden und &uuml;ber die Transkription und Translation Proteine unterschiedlichster Bauart gebildet werden, die wiederum biochemische Prozesse katalysieren, liegt es nahe, sich die Gene genauer anzuschauen, um diese f&uuml;r den jeweiligen biotechnologischen Proze&szlig; zu optimieren.
Bei einem so komplexen Gebilde, wie die DNA sie darstellt, leuchtet es jedem Chemiker ein, da&szlig; eine gentechnische Ver&auml;nderung keine einfache labortechnische Aktion ist, sondern spezielle Stoffe ben&ouml;tigt, die genau dies erm&ouml;glichen. Um 1970 herum gelang es einigen Forschern, die mit bestimmten Bakterienst&auml;mmen arbeiteten, ein Restriktionsenzym zu isolieren, das es erm&ouml;glichte, ganz spezifische &bdquo;Schnitte&ldquo; an der DNA vorzunehmen. Damit war die Geburtsstunde der Molekularbiologie bzw. der Gentechnik eingel&auml;utet.
Und wieder ist es ein passendes Enzym mit einer ganz bestimmten Struktur, das als sogenannte Endonuklease aus dem DNA-Doppelstrang eine entsprechende Gensequenz herausl&ouml;st. Bakterien k&ouml;nnen von sogenannten Bakteriophagen befallen werden. Dies sind Viren, die aus einer DNA bestehen und im Wirtsbakterium Ver&auml;nderungen bis hin zum Zelltod hervorrufen k&ouml;nnen. Durch die Restriktionsenzyme wird die &bdquo;feindliche&ldquo; DNA so ver&auml;ndert, da&szlig; sie keinen Schaden mehr anrichten kann, also ein Abwehrmechanismus aufgebaut.
Mit einem solchen Restriktionsenzym werden also chemische Bindungen im DNA-R&uuml;ckgrat, das abwechselnd aus Phopshat- und Desoxyribose-Einheiten besteht, gel&ouml;st. Es handelt sich um eine Esterbindung, die hier hydrolytisch gespalten wird. Doch die speziellen Restriktionsenzyme k&ouml;nnen nicht nur an &bdquo;gegen&uuml;berliegenden&ldquo; Stellen angreifen, sondern auch versetzt und auch die L&auml;nge der &bdquo;abgeschnittenen&ldquo; DNA-St&uuml;cke ist ebenfalls variabel. Es gibt 5 verschiedene Arten, die Typ I, II, III, IV oder V genannt werden und sich im &bdquo;Schnittmuster&ldquo; unterscheiden. Nummer V ist die von Sommer 2020 bekannte und in vielen Medien, wegen Verleihung des Nobelpreises an zwei Damen (Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna) aus der medizinischen Forschung, berichtete &bdquo;Gen-Schere&ldquo; bzw. CRISPR/CAS.
Seit etwa 1970 wird gentechnisch geforscht und der erste Modell-Mikroorganismus war Escherichia coli, also das bekannte Darmbakterium, das in Symbiose mit uns Menschen lebt. M&ouml;chte man also Proteine biotechnologisch herstellen und die Ausbeute ist nicht hoch genug, dann kann durch die genannten Methoden eine &Uuml;berexpression eines Proteins bewirkt werden, d.h. dessen Menge steigt an. Mit Genexpression ist das Ablesen des DNA-Abschnitts, also die Transkription, mit der daraus folgenden Bildung einer Boten- bzw. Messenger-RNA, einschlie&szlig;lich der Translation am Ribosom in ein entsprechend gefaltetes Protein gemeint.
Nat&uuml;rlich kann man dies auch auf andere Prozesse &uuml;bertragen und damit einen besonderen Einflu&szlig; auf die biotechnologische Herstellung eines Produkts nehmen. Oft ist es allerdings auch eine Preis- und vor allem Zeitfrage, denn dieser Vorlauf kostet recht viel Zeit und Geld, so da&szlig; es nur f&uuml;r bestimmte Anwendungen mit hoher Wertsch&ouml;pfung in Frage kommt. Aber auch diese Forschung ist noch &bdquo;im Fluss&ldquo;, so da&szlig; sich in Zukunft wahrscheinlich noch weitere M&ouml;glichkeiten f&uuml;r biotechnologische Fermentationen ergeben werden. Hier wird in Zukunft die Bioinformatik noch weitere interessante Beitr&auml;ge leisten.

Biotechnologie für Chemiker, Teil 18

Gentechnik

Neben der Aufnahme von Lichtenergie, die zum Aufbau organischer, energiereicher Verbindungen aus den anorganischen Vorstufen Kohlendioxid und Wasser dient, wie es in der Photosynthese der Fall ist, gibt es lithotrophe Mikroorganismen, die anorganische Reduktionsmittel f&uuml;r ihren Baustoffwechsel bzw. Energiegewinnung nutzen. In dieser Gruppe gibt es photolithotrophe und chemolithotrophe Mikroorganismen.
F&uuml;r Reduktionen in der Biosynthese ben&ouml;tigt ein Lebewesen reduzierende Coenzyme als Elektronen&uuml;bertr&auml;ger, die wieder regeneriert werden m&uuml;ssen. Lithotrophen Organismen gelingt diese Regeneration von Coenzymen durch Nutzung anorganischer Reduktionsmittel. Eine gro&szlig;e Rolle spielt hier das Molek&uuml;l NADP+ und das NADPH, welches auch im Calvinzyklus der Photosynthese vorkommt. So kann hier auch die anoxygene Photosynthese erw&auml;hnt werden, bei der anaerobe photlithotrophe Mikroorganismen die Lichtenergie zur Umwandlung von Schwefelwasserstoff zu elementaren Schwefel nutzen, wie es z. B. bei den Schwefelpurpurbakterien der Fall ist.
Als anorganische Reduktionsmittel dienen den lithotrophen, aeroben oder anaeroben, Mikroorganismen dabei z. B. Kohlenmonoxid, Wasserstoff, Schwefelwasserstoff, Schwefel, Nitrit- und Ammonium-Ionen. Die Redoxpotentiale spielen hierbei eine gro&szlig;e Rolle. NADP+ erfordert ein recht starkes Reduktionsmittel, damit es reduziert werden kann. Hier helfen die verschiedenen Cytochrome (redoxaktive Transmembranproteine) und umgekehrte Protonenpumpen, um die entsprechende Redoxsysteme aufzubauen, so da&szlig; die Reduktion von NADP+ zu NADPH gelingt. NADPH unterscheidet sich von NADH (Zitronens&auml;urezyklus) nur in einer Phosphatgruppe an der OH-Gruppe am C2-Atom.
Schwefelbakterien oxidieren zur Energiegewinnung Sulfide, Schwefel, Thiosulfat und Sulfit teils bis zu Sulfat, wie z. B. Acidithiobacillus thiooxidans. Nitrifizierende Bakterien wandeln Ammonium- und Nitrit-Ionen in elementaren Stickstoff oder auch Nitrat-Ionen um. Es gibt auch Mikroorganismen, wie z. B. Acidithiobacillus ferrooxidans oder Sulfobulus acidocaldarius (Temperaturoptimum 75 Grad Celsius, pH-Optimum 2 bis 3), die mittels Sauerstoff zweiwertige Eisen-Ionen zu dreiwertigen Eisen-Ionen oxidieren. Die beiden genannten Bakterien, tolerieren niedrige pH-Werte und wurden in Sauerw&auml;ssern gefunden, die aus Pyrit-haltigen Bergbauhalden sickern. Beide Bakterien werden f&uuml;r das sogenannte &bdquo;Bioleaching&ldquo; genutzt, auch mikrobielle Erzlaugung genannt, bei der unl&ouml;sliche Erzmineralien in l&ouml;sliche Formen &uuml;berf&uuml;hrt und anschlie&szlig;end aufgearbeitet werden.
Die Schwefelbakterien finden sich oft an Quellen, an denen warmes bis heisses Wasser aus der Tiefe tritt, wie z. B. im submarinen Bereich. Es sind Hydrothermalquellen, die sich auf dem Grund des Ozeans befinden und oft mit vulkanischen submarinen Aktivit&auml;ten an tektonischen Plattengrenzen verbunden sind. In den Ozeanen gibt es sogenannte &bdquo;Schwarze Raucher&ldquo; und auch &bdquo;Weisse Raucher&ldquo;, die sich durch Mineralabscheidungen zu erkennen geben und dabei auch gr&ouml;&szlig;ere, interessant gestaltete Unterwassert&uuml;rme aufbauen. Man nennt sie auch Tiefseeschlote.
Der schwarze Raucher &bdquo;Kandelabra&ldquo; liegt in einer Tiefe von 3300 Metern am mittelatlantischen R&uuml;cken. Auch im Indischen und Pazifischen Ozean hat man Tiefseeschlote gefunden (siehe Link). Hydrothermalquellen sind ein Biotop f&uuml;r sich. Dort trifft das mit 300 bis 400 Grad Celsius austretende Wasser auf 2 Grad Celsius kaltes Wasser am Meeresboden. Dabei fallen die darin gel&ouml;sten Mineralien aus. In der Umgebung von Hydrothermalquellen leben Archaeen und Bakterien und nutzen als chemolithotrophe Mikroorganismen einerseits die vorhandene W&auml;rme, als auch den Schwefelwasserstoff und die vorhandenen Mineralien, wie z. B. Eisen, Zink. Kupfer, Mangan. Licht gibt es in dieser Tiefe keines mehr und spielt daher f&uuml;r Mikroorganismen keine Rolle.
<a class="url-external foundation-icon-core-externallink" href="https://www.eskp.de/schadstoffe/schwarze-raucher-auf-dem-meeresboden-935546/" rel="nofollow noopener noreferrer" target="_blank">https://www.eskp.de/schadstoffe/schwarze-raucher-auf-dem-meeresboden-935546/</a>
Die blaue Biotechnologie wird auch marine Biotechnologie genannt, ist noch recht jung und k&uuml;mmert sich um nutzbare biologische Systeme in den Ozeanen und Meeren dieser Welt. Aufgrund der Tatsache, da&szlig; sich das Leben im Meer entwickelt hat, hat es, gegen&uuml;ber den am Land befindlichen Lebensformen, einen Zeitvorsprung von etwa 1 Milliarde Jahre. Daher ist die submarine Vielfalt noch gr&ouml;&szlig;er als jene am Land. Weil diese Ozeane mit ihren gro&szlig;en Tiefen nicht so leicht zug&auml;nglich sind, ist die Erforschung noch nicht so weit fortgeschritten, wie in anderen Bereichen der Biotechnologie.
Da es noch eine ganze Menge unentdeckter Tiefsee-Mikroorganismen gibt, die zudem auch noch anaerob Methan produzieren, besteht hier nat&uuml;rlich ein recht gro&szlig;es Interesse weitere Untersuchungen anzustellen. Bei Methan in diesen Tiefen des Ozeans und bei den dort vorherrschenden Temperaturen k&ouml;nnte man noch &uuml;ber Methan-Clathrate sprechen, was ich hier aber nicht weiter ausf&uuml;hren m&ouml;chte. Die Menge an Methan, die durch marine Methanogene hergestellt wird und sich in den Ozeanen befindet, wird weltweit auf mehr als alle andere fossile Energietr&auml;ger gesch&auml;tzt.

Biotechnologie für Chemiker, Teil 17

Chemolithotrophie

Pflanzen, (Mikro-)Algen und Cyanobakterien betreiben Photosynthese, d.h. es liegen Zellen vor, die Chloroplasten beinhalten, in denen unter Ausnutzung der Lichtenergie aus den anorganischen Vorstufen Kohlendioxid und Wasser energiereiche organische Verbindungen (Glucose) aufgebaut werden. Solche Zellen werden auch als photoautotrophe Systeme bezeichnet.
Photoautotrophen Systemen k&ouml;nnen auf oxischer oder anoxischer Basis funktionieren. Es gibt somit auch Mikroorganismen, die nur die Lichtenergie nutzen, ohne dabei auch Sauerstoff zu produzieren. Bei der oxischen Variante wird allerdings Sauerstoff gebildet, der durch andere Mikroorganismen, die Dissimilation betreiben, wieder verbrauchen. Dissimilation findet man bei heterotrophen Mikroorganismen, d.h. sie oxidieren vorhandene organische Verbindungen zu Kohlendioxid und Wasser. Es liegt hier insgesamt ein Kreislaufsystem aus Assimiliation und Dissimilation vor.
In den Chloroplasten, die den gr&uuml;nen Blattfarbstoff Chlorophyll (derivatisierter Porphyrin-Chelat-Komplex mit Mg2+ als Zentral-Ion) beinhalten, l&auml;uft die Photosynthese an der Thylakoidmembran ab. Diese befindet sich im Innern der Chloroplasten, in der geschichtete &bdquo;Scheibchen&ldquo; &uuml;bereinander liegen. An dieser Membran gibt es zwei Photosysteme I und II mit Lichtabsorptionsmaxma bei Licht der Wellenl&auml;nge von 680 nm und 700 nm. Mittels dieser Lichtenergie werden Wassermolek&uuml;le &uuml;ber eine Kaskade von Redoxreaktionen in elementaren Sauerstoff und H+ -Ionen und Elektronen aufgespalten. So werden aus 2 Molek&uuml;len Wasser ein Molek&uuml;l Sauerstoff, vier H+ -Ionen und vier Elektronen. Die Elektronen wandern in einer Art Elektronentransportkette &uuml;ber Redoxsysteme, wie z. B. Ferredoxine (Fe- und S-haltige Redox-Enzyme) und Plastochinone (Chinon-Hydrochinon-System), weiter und f&uuml;hren letztlich mit den H+ -Ionen zur Bildung von NADPH (Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat) und ATP (Adenosintriphosphat). Der komplette Ablauf ist sehr komplex und kann in K&uuml;rze hier nicht dargestellt werden.
Beide Stoffe (NADPH und ATP) sind Energiespeicher und werden im lichtunabh&auml;ngigen Teil der Photosynthese, n&auml;mlich dem Calvin-Zyklus, als reaktives Agens eingesetzt. Der Calvin-Zyklus beginnt beim 3-Phosphoglycerat und f&uuml;hrt &uuml;ber mehrere Zwischenstufen zu Ribulosebisphosphat, einer zweifach phosphorylierten Ketopentose. An einem Punkt im Calvin-Zyklus entsteht auch Glycerinaldehydphosphat, abgek&uuml;rzt GAP. Dieser C3-Baustein kann in der Gluconeogenese zur Bildung von Glucose verwendet werden, weil die Glykolyse reversible Reaktionsschritte beinhaltet. Die gebildete Glucose kann anschlie&szlig;end in St&auml;rke oder Cellulose umgewandelt werden. Cellulose ist der Ger&uuml;ststoff f&uuml;r Pflanzen, wobei hier noch zu erw&auml;hnen ist, da&szlig; Pflanzen im Sekund&auml;rstoffwechsel noch eine Menge weiterer organischer Stoffe bilden, die prinzipiell interessant sein k&ouml;nnen. Der Sekund&auml;rstoffwechsel umfasst generell alle Synthesepfade, die nicht dirket zum Leben der Zelle notwendig sind. Dabei k&ouml;nnen z. B. Kohlenhydrate, Proteine, Vitamine, unges&auml;ttigte Fetts&auml;uren, Beta-Carotine, Farb- und Duftstoffe, Coffein, Terpene, entstehen.
Wenn in einem Photobioreaktor unter Lichteinflu&szlig; Mikro-Algen in einem diskontinuierlichen Verfahren kultiviert werden, wird Kohlendioxid (unser Treibhausgas, neben Methan) gebunden. Es gibt auch kontinuierliche Anlagen, wie z. B. den R&ouml;hren-, den Helix- bzw. Coil- und den Platten-Reaktor, in denen allesamt f&uuml;r viel Lichteinfall gesorgt wird. Wichtig ist hier, dass die Mikro-Algen nicht an der Wand haften bleiben, da sie sonst die Lichtaufnahme verringern.
Als besondere Variante gibt es eine Form, die sich &bdquo;Raceway Ponds&ldquo; nennt. &Uuml;bersetzt steht es f&uuml;r Rennstrecken - Teiche. Es handelt sich um eine spezielle, offene Form eines gewundenen, flachen Kanals mit einer Umw&auml;lzungsmaschine, die die fluide Phase in Bewegung h&auml;lt. Dabei kommt viel Licht rein und die Algenbildung wird so gef&ouml;rdert. Als Beispiel m&ouml;chte ich die Firma Cyanotech in den USA nennen, die auf Hawai in Kailua Kona eine gro&szlig;e Anlage mit &bdquo;Raceway Ponds&ldquo; betreibt (siehe Link mit tollen Fotos und Luftaufnahmen) und dort Algen der Sorte &bdquo;Spirulina&ldquo; und &bdquo;Astaxanthin&ldquo; herstellen. Die Firma wurde bereits 1983 gegr&uuml;ndet, allerdings erst in Nevada, und zog sp&auml;ter um nach Hawaii, weil dort die Bedingungen besser waren.
<a class="url-external foundation-icon-core-externallink" href="https://www.cyanotech.com" rel="nofollow noopener noreferrer" target="_blank">https://www.cyanotech.com</a>

Biotechnologie für Chemiker, Teil 16

Photosynthese

Bei biotechnologischen Fermentationen m&uuml;ssen s&auml;mtliche Arbeitsschritte unter sterilen Bedingungen ablaufen, um Fremdkontamination zu vermeiden.
Eine Sterilisation kann physikalisch oder chemisch erfolgen. Chemisch sterilisiert werden Einwegartikel aus Kunststoff mittels Formaldehyd oder Ethylenoxid. Physikalische Sterilisationen sind mit Mikrowellen, Beta- oder Gammastrahlung m&ouml;glich, allerdings nur f&uuml;r entsprechend unempfindliche Materialien.
Eine weitere M&ouml;glichkeit besteht im Erhitzen auf &uuml;ber 100 Grad Celsius mit Trocken- oder Nassdampf. Trockener Dampf kann bei anorganischen Oberfl&auml;chen eingesetzt werden, einschlie&szlig;lich einer h&ouml;heren Temperatur von bis zu 200 Grad Celsius. Feuchte Hitze ist in der Regel besser, denn sie dringt in alle Ritzen und Fugen und wird unter einem Druck von 2 bis 3 bar durchgef&uuml;hrt. Eine g&auml;ngige Methode ist Sattdampf bei 121 bzw. 135 Grad Celsius und 2 bzw. 3 bar Druck f&uuml;r 20 bzw. 15 Minuten.
Bei temperaturempfindlichen Stoffen bietet sich die Sterilfiltration an und es kommen hier Ultra- und Nanofiltration-Membranen zur Anwendung. Auch die in einen Bioreaktor zugef&uuml;hrte Luft f&uuml;r aerobe Mikroorganismen mu&szlig; vor der Zuleitung durch einen Filter. Dasselbe gilt f&uuml;r die Abluft mit Kohlendioxid.
Bei einem diskontinuierlichen Ansatz kommen zun&auml;chst alle Komponenten, wie z. B. Substrat, N&auml;hrstoffe, Mineralien, in einem Batchreaktor, der dann anschlie&szlig;end f&uuml;r mindestens 20 Minuten bei 121 Grad Celsius und 2 bar mit feuchter Hitze steriliert wird. Danach wird steriles Wasser als fluides Medium hinzugegeben und zum Schlu&szlig; das Inokulum, d.h. eine kleine Menge des Mikrorganismus, der vorher in einem separaten Gef&auml;&szlig; kultiviert wurde. Nach einer lag-Phase kommt die exponentielle Phase, in der die Konzentration der Mikroorganismen bzw. Biomasse um Zehnerpotenzen ansteigt. Damit beginnt auch die Produktion eines bestimmten Produkts bei gleichzeitigem Verbrauch von Substrat.
Der zeitliche Verlauf von Biomasse- und Produktbildung verbunden mit Substratverbrauch ist allerdings unterschiedlich. So gibt es Produkte, die zellwachstum-abh&auml;ngig gebildet werden und jene die nahezu unabh&auml;ngig vom Zellwachstum gebildet werden. Tr&auml;gt man die Biomasse- und Produktbildungsrate, einschlie&szlig;lich der Substratverbrauchsrate gegen die Zeit auf, ergeben sich 3 verschiedene Verl&auml;ufe.
Es h&auml;ngt davon ab, ob ein Produkt im Prim&auml;rstoffwechsel (alle lebenswichtigen Prozesse), im Sekund&auml;rstoffwechsel (alle nicht lebensnotwendigen Prozesse) oder damit verbundenen Nebenwegen entsteht. Wichtig ist: Substrat wird f&uuml;r die Bildung von Biomasse, von Produkt und etwas zum Leben der Zellen ben&ouml;tigt.
Somit gibt es Typ I, bei dem Biomasse-, Produktbildungs- und Substratverbrauchsrate nahezu deckungsgleich liegen, d.h. so wie Biomasse neu entsteht, wird Substrat verbraucht und fast gleichzeitig Produkt gebildet. Dies bebachtet man bei Stoffen die aus dem Prim&auml;rstoffwechsel kommen, wie z. B. Ethanol, Essigs&auml;ure, Butanol.
Bei Typ II ist die Biomassebildungsrate am Anfang hoch und parallel dazu der Substratverbrauch, w&auml;hrend erst im zweiten Zeitabschnitt die Produktbildungsrate stark zunimmt, neben einem kleinen Anstieg der Biomassebildungsrate und einem mittleren Anstieg der Substratverbrauchsrate. Dies ist bei Aminos&auml;uren der Fall, die in den Nebenwegen des Prim&auml;rstoffwechsels gebildet werden.
Im Fall von Typ III verlaufen die Biomassebildungsrate und die Substratverbrauchsrate zun&auml;chst parallel und gehen dann stark zur&uuml;ck, wobei dann, zeitlich verschoben, ein kr&auml;ftiger Anstieg der Produktbildungsrate erfolgt. Das Produkt kommt erst sp&auml;ter, zeitlich betrachtet, d.h. eine zu fr&uuml;he Ernte ist nachteilig in Bezug auf die Produktausbeute. Dies wird bei der biotechnologischen Produktion von Vitaminen und Antibiotika beobachtet.
Fazit: nicht alle biotechnologischen Produkte entstehen sofort w&auml;hrend der Bildung von Biomasse, d.h. Zellvermehrung. Es handelt sich dabei nicht um zeitliche Unterschiede in Minute, sondern in Stunden.

Biotechnologie für Chemiker, Teil 15

Produktbildungskinetik

Fettsäuren (aus hydrolysierten Lipiden) sind langkettige Carbonsäuren, ab etwa 10 bis 12 C-Atomen. Auch diese können bei aeroben Mikroorganismen verwertet werden und tragen ihren Teil zur Energiegewinnung beim Zitronensäurezyklus und der sich anschließenden Atmungskette bei.

Fettsäuren sind demnach eine Alternative als Substrat für Mikroorganismen, auch wenn deren Umwandlung etwas mehr Zeit in Anspruch nimmt, als die Glykolyse.

Bei der sogenannten Beta-Oxidation, die in den Mitochondrien abläuft, werden Carbonsäuren mit einer geradzahligen Anzahl von C-Atomen Stück für Stück in C2-Bausteine gespalten, die dann in den Zitronensäurezyklus einfließen.

Zunächst wird die langkettige Carbonsäure mit der SH-Gruppe des Coenzyms A zu einem Thioester umgewandelt.
 Danach erfolgt eine Dehydrierung mittels FAD (Flavin-Adenin-Dinukleotid), so daß die trans-Form des alpha-beta-ungesättigten Carbonsäure-Esters entsteht.
 Anschließend wird mittels Hydratase Wasser an die Doppelbindung angelagert und es bildet sich dabei die beta-Hydroxy-Carbonsäure.
 Im nächsten Schritt wird die beta-Hydroxy-Gruppe mittels NAD+ (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid) zum Keton oxidiert, so daß jetzt eine beta-Keto-Carbonsäure vorliegt.
 In einer folgenden enzymkatalysierten Reaktion mit CoEnzym A (CoA) wird die beta-Keto-Carbonsäure in Acetyl-CoA und Acyl-CoA gespalten.

Das Acetyl-CoA reagiert dann im Zitronensäurezyklus mit Oxalessigsäure zu Zitronensäure und weiteren Folgeprodukten, wie z. B. Aconitsäure, Isocitronensäure, alpha-Ketoglutarsäure, Succinat-Coenzym A, Fumarsäure und Äpfelsäure.
 Die im Zitronensäurezyklus gewonnenen NADH, FADH2 und GTP gehen dann in die Atmungskette über und bewirken dort die Synthese von ATP.
 All das findet in den Mitochondrien statt, die zu recht als Kraftwerk der Zelle bezeichnet werden.
 Alternativ kann Acetyl-CoA auch über die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat und anschließende Umsetzung mit CoEnzym A gewonnen werden, welches als Glykolyse-Endprodukt vorliegt.

Das für die Beta-Oxidation wichtige redoxaktive Enzym Flavin besteht aus Vitamin B2, das mit Adenosindiphosphat verknüpft ist. Vitamin B2 wird bei der BASF biotechnologisch mit dem Mikroorganismus Ashbya gossypii hergestellt. Diese Mikroorganismen sind in der Lage Fettsäuren als Substrat zu verwerten. Sie wurden diesbezüglich gentechnisch optimiert.

Normalerweise läuft bei Anwesenheit von Glucose die Glykolyse ab, jedoch nicht bei Glucosemangel. In so einem Fall schaltet die Zelle auf „Fettverbrennung“ um, so daß Lipide in Glycerin und Fettsäuren gespalten werden und dann über die beta-Oxidation in Acetyl-CoA umgewandelt werden.

Betrachtet man die Menge an Acetyl-CoA, die aus einem Molekül Dodecansäure entstehen kann, so fällt einem auf, dass hier 6 Acetyl-CoA entstehen, während die Glykolyse pro Glucosemolekül nur 2 Acetyl-CoA liefert. Dies resultiert in einer größeren Menge an ATP-Molekülen.
 Während beim Zitronensäurezyklus etwa 32 ATP herauskommen, sind es beim Einsatz von Dodecan- bzw. Laurinsäure 78 ATP, bei Tetradecan- bzw. Myristinsäure 92 ATP, bei Hexadecan- bzw. Palmitinsäure 106 ATP und bei Octadecan- bzw. Stearinsäure sogar 120 ATP. Dies ist ein großer Unterschied und zeigt deutlich den Energieinhalt von Fettsäuren.

Biotechnologie für Chemiker, Teil 14

Substrate für Mikroorganismen, Teil 2

Substrate für Mikroorganismen bzw. Zellen könnte man auch als Futter bzw. Nahrung bezeichnen, ohne die kein Leben möglich ist, keine Zellvermehrung und kein primärer und sekundärer Stoffwechsel.

So wie der Mensch täglich Nahrung zu sich nehmen muss, darunter sind natürlich auch Vitamine, Aminosäuren, Mineralien, Spurenelemente, gilt dies auch für die kleinen Produktionseinheiten, in denen viele biochemische Prozesse ablaufen. Der notwendige „Brennstoff“ im wässrigen Milieu ist hierbei die Glucose. Jenes Molekül, das beim Zeichnen etwas Mühe macht, denn es gibt, neben der offenkettigen R,S- bzw. D,L-Form, auch noch zwei Anomere, also die alpha- und die beta-Form.

Die Glykolyse ist der Umwandlungsprozess von Glucose in Pyruvat (das Salz der Brenztraubensäure, die einfachste alpha-Ketocarbonsäure). Dabei wird die ringförmige Glucose an der C6-OH-Gruppe phosphoryliert und anschließend in die entsprechende Fructoseform isomerisiert, um dann an der C1-OH-Gruppe noch einmal phosphoryliert zu werden. Die Phosphorylierung wird mit ATP (Adenosintriphosphat) durchgeführt.

1,6-Fructosediphosphat wird dann enzymatisch in zwei C3-Moleküle gespalten, die sich Glycerinaldehyd-3.phosphat und Dihydroxyacetonphosphat nennen. Beide Stoffe sind isomer zueinander und werden über mehrere Zwischenstufen, wie z. B. das Phosphoenolpyruvat in Pyruvat umgewandelt. Dabei entsteht pro Pyruvatmolekül ein NADH (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid) und ein ATP. In der Summe kommt aus der Glykolyse ein Energiegewinn von 2 ATP. Das ist nicht sonderlich viel. Bis zu diesem Schritt wird kein Sauerstoff benötigt, d.h. sowohl aerobe, als auch anerobe Mikroorganismen durchlaufen diesen Prozeß (Ausnahme: Methanogene).

Weil Fructose isomer zu Glucose ist und über die offenkettige Form mit der Endiol-Form als Zwischenstufe ineinander umgewandelt werden kann, kann somit auch Fructose als Substrat eingesetzt werden, weil das dazu erforderliche Enzym vorhanden ist, das diese Reaktion katalysiert.

Bei dem Prozess der Gärung kann neben der Glucose, auch Fructose verstoffwechselt werden. Galactose und Mannose unterscheiden sich von Glucose nur in der Stellung der C4- bzw. C2-OH-Gruppe und können mit den jeweiligen Enzymen zu phosphorylierter Glucose bzw. Fructose isomerisiert werden. Bei den Monosacchariden können demnach vier verschiedene für die Gärung als Substrat verwendet werden.

Es gibt aber auch noch Di- und Trisaccharide, wie z. B. die Maltose, die Cellobiose, die Trehalose, die Lactose, die Saccharose. Aufgrund der Existenz von Hydrolasen können alle genannten Disaccharide in die jeweiligen Monosaccharide gespalten und dann der Glykolyse zugeführt werden. Auch beim Trisaccharid Raffinose kann durch Hydrolasen die Spaltung in die drei Komponenten Galactose, Glucose und Fructose durchgeführt werden.
 Somit können alle genannten Di- und Trisaccharide auch für die Gärung verwendet werden. Alle erwähnten Mono-, Di- und Trisaccharide findet man in der Melasse, einem Nebenprodukt bei der Zuckerherstellung, aus dem der Zucker nicht mehr durch Auskristallisieren gewonnen werden kann.

Bei der Spaltung von Polysacchariden, wie z. B. Stärke oder Cellulose kommen andere Enzyme zum Einsatz.

Die Amylase, die beim Keimen von Getreide „geweckt“ wird, spaltet die Stärke in Maltose und Glucose. Sie liegt in zwei unterschiedlichen Formen vor, d.h. die alpha-Form spaltet innere alpha-1,4-glykosidische Verknüpfungen, während die beta-Form vom Kettenende her abbaut bzw. hydrolysiert. Da Stärke auch aus Amylopektin besteht, gibt es auch für dieses vernetzte Polysaccharid ein Enzym, das alpha-1,6-glykosidische Verknüpfungen hydrolysiert.

Bei der Cellulose gibt es sogenannte endo- und exo-Cellulasen, die innere beta-1,4-glykosidische Verknüpfungen hydrolysieren (endo) und jene, die vom Kettenende her hydrolytischen Abbau (exo) betreiben. Hier entsteht zunächst die beta-D-Glucose, die aber mit alpha-D-Glucose im Gleichgewicht steht.
 Bei Pilzen kommen diese Enzyme vor, denn diese lysieren die in der Umgebung befindlichen Kohlenhydrate, nehmen sie in löslicher Form auf und führen sie der Energiegewinnung der eukaryoten Zelle zu. Nicht umsonst lassen sich Pilze gerne auf moderndem Holzstämmen nieder.