Ein Farbstoff wird zur biologischen Sonde

Azobenzole in Zellen aktivieren und deaktivieren Ionenkanäle, wenn sie mit Licht bestrahlt werden. Solche Einsatzzwecke in biologischen Systemen haben besondere Anforderungen, etwa bei Absorptionsmaximum und Löslichkeit. Das erfordert damals wie heute kluge Synthesestrategien.

Johann Peter Grieß entdeckte Mitte des 19. Jahrhunderts, wie sich Diazoniumsalze herstellen lassen (Abbildung 1a) und ermöglichte so Farbstoffe aus Azobenzolen.¹⁾ Basierend auf seinen Arbeiten wurden Färbemittel entwickelt, und es zeigte sich, dass Azobenzole noch mehr können: In den 1930ern entdeckten Josef Klarer und Fritz Mietzsch bei Bayer die antimikrobielle Wirkung von Sulfamidochrysoidin (Abbildung 1b). Unter dem Namen Prontosil kam es als erstes synthetisches Antibiotikum auf den Markt. Wie sich erst später zeigte, metabolisiert Prontosil im Körper zum eigentlichen Wirkstoff para-Aminobenzsulfonamid (Sulfanilamid, Abbildung 1b), fungiert also als Vorläuferverbindung (engl. prodrug).²⁾

Die Schlüsseleigenschaft

Ebenfalls in den 1930ern entdeckte Hartley in England eine weitere Eigenschaft von Azobenzol: Wird das thermodynamisch stabile E-Isomer mit UV-Licht bestrahlt, geht es in die metastabile Z-Konfiguration über (Abbildung 1a).³⁾ Die Reaktion erwies sich als thermisch und später auch als photochemisch reversibel und machte Azobenzol damit zu einem der ersten Photoschalter. In den folgenden Jahrzehnten wurden mit Photoschaltern Materialeigenschaften verändert, beispielsweise in selbstverdunkelnden Sonnenbrillen. Ab den 1980ern waren sie Teil von Sonden in biologischen Systemen oder Photopharmazeutika. Dieser Begriff etablierte sich in den 2000er Jahren. Wenn Azobenzole in biologisch aktive Moleküle oder Biomakromoleküle wie DNA, Proteine oder Lipide eingebaut sind, steuern die photochemischen Isomerisierungen die biologische Aktivität.⁴⁾

Zum Photoschalter maßschneidern

Aus den Anwendungen folgten neue Anforderungen. Die Zielmoleküle sollten sich im biologischen wässrigen Medium lösen und Wirkstoffen in weiteren Parametern ähneln, zum Beispiel der Membrangängigkeit.

Zudem müssen die Photoschalter chemisch stabil sein, dürfen also beispielsweise nicht wie Prontosil metabolisiert werden. Auch soll die photochemische Isomerisierung effizient ablaufen, also mit hohen Quantenausbeuten, und möglichst quantitativ (E→Z und Z→E). Um kompatibel mit biologischen Proben zu sein, sollte das Anregungslicht kein schädliches UV-Licht sein, sondern entweder sichtbares Licht (etwa 400–800 nm) oder idealerweise zwischen 700 und 900 nm liegen, da diese Wellenlängen Gewebe tiefer durchdringen.^4–6)

Verschiedene Synthesestrategien werden diesen Ansprüchen gerecht.

Isomerie mit sichtbarem Licht

Woolley, Hecht, Feringa, Szymanski und andere haben E- und Z-konfigurierte tetra-ortho-substituierte Azobenzole mit sichtbarem Licht isomerisiert.

Dies gelang, da die ortho-Substituenten F, Cl, OR oder NR₂ das ansonsten planare E-Isomer verdrehen. Dadurch verschiebt sich der nπ*-Übergang der N=N-Bindung bathochrom, und die Absorptionsmaxima der beiden Konfigurationen entfernen sich voneinander.^6,7)

Vor allem die halogenierten Analoga sind stabil gegenüber biologischen Reduktionsmitteln, und die metastabilen Isomere können thermische Halbwertszeiten von bis zu mehreren Tagen erreichen.^6,8)

Die Moleküle lassen sich wie klassische Azobenzole herstellen. Die tetra-ortho-substituierten Derivate entstehen über Diazo- oder Bayer-Mills-Reaktion (Abbildung 2).^8,9) Diese sind oft weniger reaktiv als die unsubstituierten Derivate und erfordern teils harschere Reaktionsbedingungen. Bléger und Kolleg:innen haben Tetra-ortho-Fluoroazobenzol über eine Bayer-Mills-Reaktion hergestellt, und zwar in einer Mischung aus Essigsäure, Toluol und Trifluoressigsäure (TFA) (Abbildung 2).⁹⁾

Feringa, Szymanski und Kolleg:innen haben aus 2,6-Difluoroanilin direkt die Diazoverbindungung synthetisiert. Dazu haben sie einen Lithiumaromaten aus n-BuLi und 1,5-Difluorobenzol hergestellt und mit dem Diazoniumsalz umgesetzt (Abbildung 2). Die Reaktion funktioniert auch mit ortho-OMe- und ortho-Cl-substituierten Verbindungen (Abbildung 2).¹⁰⁾ Aus Tetra-ortho-fluoroazobenzol und 2,6-Difluoroanilin entsteht oxidativ mit einer Mischung aus KMnO₄ und FeSO₄ in heißem Dichlormethan das entsprechende Azobenzolderivat.⁹⁾

Eine ähnliche Reaktion nutzten Woolley und Mitarbeiter, um 2,6-Dimethoxyanilin mit AgO in Aceton zu oxidieren.⁸⁾ Allerdings produzieren die Oxidationen und Reduktionen lediglich symmetrisch substituierte Azobenzole.

Asymmetrische Azobenzole

Sollen asymmetrische Verbindungen via Diazo-, Bayer-Mills- und Redoxreaktionen entstehen, muss üblicherweise der tetra-ortho-substituierte Farbstoff im ersten Schritt aufgebaut werden. Im Anschluss entsteht der biologisch aktive Stoff, indem Substituenten modifiziert oder eingeführt werden. Bibliotheken derselben Substanz zu erstellen, die unterschiedliche Photoschalter enthalten, ist synthetisch aufwendig. Denn dafür sind verschiedene Grundkörper nötig.

Möglichst spät variieren

Attraktiver wäre, erst im letzten Syntheseschritt die ortho-Substituenten einzuführen. Wie Trauner und Kollegen gezeigt haben, lassen sich ortho-Cl-Substituenten in einer späten Synthesestufe einführen. Dazu aktivierten sie die C-H-Bindung Palladium-katalysiert und verwendeten N-Chlorsuccinimid (NCS) als Cl-Quelle.¹¹⁾

Auf andere Weise haben Siewersten et al. Azobenzole realisiert, die sich ausschließlich mit sichtbarem Licht steuern lassen. Das Team hat 5,6-Dihydrodibenzo[c,g][1,2]diazozine (Abbildung 3) synthetisiert – cyclische Azobenzole, deren Z-Isomer aufgrund der Ringspannung das thermodynamisch stabilere ist (Abbildung 3). Ähnlich den tetra-ortho-substituierten Azobenzolen ist das E-Isomer in eine non-planare Konformation gezwungen, was auch hier den nπ*-Übergang bathochrom verschiebt. Licht bei 385 nm beziehungsweise 520 nm isomerisiert die Moleküle reversibel.¹²⁾

Diazozine entstehen zum Beispiel aus ortho-Nitrotoluol durch oxidative C-C-Bindungsknüpfung und anschließende Reduktion zur N=N-Bindung (Abbildung 3).¹³⁾ Staubitz und Mitarbeiter zeigen eine Alternative: Dabei kuppelt eine zweifach halogenierte Vorstufe reduktiv mit Bis-Boc-Hydrazin, gefolgt von Palladium-katalysierter Kreuzkupplung und Oxidation. Diese Reaktivität ist bislang allerdings auf Derivate mit C₂H₄-Brücken begrenzt.

Herges und Mitarbeiter:innen haben Heteroatome in die CH₂X-Brücke (X = O oder S¹⁴⁾ sowie NAc oder N-Alkyl¹⁵⁾) eingeführt, was meist über Redoxchemie erfolgt.¹⁶⁾

Langwellig absorbierende und thermisch wie chemisch stabile tetra-ortho-substituierte Azobenzole herzustellen, ist schwierig. Heteroaromatische Verbindungen bieten hier synthetische Alternativen.

Elektronenreiche Heteroaromaten

Die photochemische Isomerisierung von Azopyridinen wurde in den 1950er Jahren beschrieben, um dieselbe Zeit wie die von Azobenzol. Aber erst durch die größere Nachfrage der Forscher:innen in den letzten Jahren erforschten und optimierten Wissenschaftler:innen neue synthetische Methoden.¹⁷⁾

Elektronenreiche Heteroaromaten eignen sich besonders gut, um Diazoniumsalze abzufangen. So reagiert zum Beispiel Ph-N₂⁺ direkt mit Indolen in quantitativen Ausbeuten zu den photoschaltbaren Azofarbstoffen (Abbildung 4).¹⁸⁾ Das Absorptionsspektrum der Phenylazoindole ist im Vergleich zum analogen Azobenzol bathochrom verschoben, und die Moleküle isomerisieren ohne weitere Substituenten mit violettem Licht. Die thermische Halbwertszeit der metastabilen Z-Isomere ist für Indole extrem kurz: Nano- bis Mikrosekunden für N-methylsubstituierte Indole, also ähnlich der elektronenreicher Azobenzole.¹⁹⁾

Velasco und Mitarbeiter:innen haben elektronenreiche Heteroaromaten über Diazoniumchemie in Azobenzole umgesetzt. Sie fokussierten sich dabei auf Systeme mit kurzlebigen, metastabilen Z-Isomeren und Anregungslicht im sichtbaren, biokompatiblen Bereich. Dies erreichten sie zum Beispiel, indem sie mehrere Pyrrole und Thiophene (Abbildung 4) aneinanderkoppelten.²⁰⁾

Wegner und Kolleg:innen haben Ph-N=N-funktionalisiertes Thiophen hergestellt. Dazu setzten sie 2-Bromothiophen in einer Umpolungsreaktion mit ⁱPrMgCl × LiCl und anschließend mit einem Aryldiazoniumsalz zur gewünschten Azoverbindung um (Abbildung 5).²¹⁾

Besonders populär sind 4-Phenylazopyrazole,¹⁷⁾ denn beide Isomere isomerisieren meist fast quantitativ, und die thermischen Halbwertszeiten der metastabilen Isomere sind oft länger als die der Azobenzole. Ihr Absorptionsspektrum unterscheidet sich zwar wenig von Azobenzolen mit elektronenreichen para-Substituenten, sie lösen sich jedoch leichter in Wasser, und daher eignen sie sich besser für biologische Systeme. Klassisch werden sie aus Anilin dargestellt, mit NaNO₂ in ihr Diazoniumsalz überführt und anschließend mit Acetylaceton in gepuffertem wässrigem Medium abgefangen. Das so entstandene Bisketon reagiert mit einem Hydrazon zum Pyrazolanalogon (Abbildung 5).^22,23) Das entsprechende Isoxazol lässt sich genauso darstellen, wenn Hydroxylamin den Ring schließt.²⁴⁾ Die 3(5)-Arylazopyrazole werden mehrheitlich über Bayer-Mills-Reaktionen dargestellt (Abbildung 5).²⁵⁾

Elektronenarme Heteroaromaten

Elektronenarme Aromaten wie Purine lassen sich in einer nukleophilen aromatischen Substitutionsreaktion mit Boc-Hydrazin-dekorierten Aromaten umsetzen und anschließend zur Azoverbindung oxidieren. Feringa und Mitarbeitende zeigten dies in einem Mikrowellenreaktor, gefolgt von Oxidation mit Luftsauerstoff (Abbildung 6).²⁶⁾ Dieselben Heteroarylazobenzole lassen sich Palladium-katalysiert aus ähnlichen Grundkörpern darstellen, wie Grøtli und Mitarbeitende zeigten. Sie setzten Phenyl-Boc-Hydrazin mit Arylbromiden in Gegenwart von Pd(OAc)₂, ^tBu₃P und Cs₂CO₃ um, gefolgt von thermischer Boc-Entschützung und Oxidation mit Sauerstoff (Abbildung 6).²⁷⁾

Carreira und Mitarbeitende haben Phenylazotriazole Cu^I-katalysiert aus organischem Azid R-N₃ und Ph-N=N-funktionalisiertem Alkin in einer Klickreaktion erzeugt (Abbildung 6).²⁸⁾ Diese Chemie bringt Azo-Photoschalter direkt bioorthogonal ins Zielmolekül.

Biologische Studien

Sowohl Heteroaryl- als auch tetra-ortho-substituierte Azobenzole dienten bereits als Werkzeuge in biologischen Studien und helfen, bestimmte Prozesse in Modellen in vivo zu untersuchen. Beispielsweise hemmten und aktivierten Yang et al. mit Licht reversibel den Ca²⁺-sensitiven calcium release-activated calcium channel (CRAC-Kanal) in Zebrafischen mit einem Phenylazopyrazol (Abbildung 7).²⁹⁾ Ebenfalls im Zebrafischmodell steuerten Vázquez und Mitarbeitende mit sichtbarem Licht einen peptidischen tetra-ortho-fluorobasierten Photoschalter und gewannen damit neue Erkenntnisse zur Hämatopoese, also der Neubildung von Blutzellen.³⁰⁾

Wie diese Beispiele zeigen, führen Modifikationen in Azobenzolphotoschaltern zu hochfunktionalisierten chemisch-biologischen Sonden und künftig vielleicht zu lichtregulierbaren Pharmazeutika.

Mit zunehmenden synthetischen Methoden lassen sich photoaktive Grundkörper flexibler herstellen, bioorthogonale Reaktionen realisieren und bioaktive Moleküle auf einer späten Synthesestufe modifizieren.

AUF EINEN BLICK

Licht isomerisiert Azobenzole; werden sie in biologische Systeme eingebaut, können Azobenzole diese Systeme gezielt beeinflussen.

Symmetrische Azobenzole sind leichter herzustellen als asymmetrische Derivate.

Gegenüber Azobenzolen haben Heteroaromaten Vorteile. Zum Beispiel lassen sich ihre Absorptionsspektren leichter optimieren.

Das ist der letzte Blickpunkt-Synthese-Beitrag der Autorin Nadja Simeth. Seit Mai 2023 betreut sie die Serie abwechselnd mit Christopher Teskey.

Die Autorin

Nadja Simeth ist Juniorprofessorin an der Universität Göttingen. Ihre Gruppe forscht an photochemischer Markierung und Regulierung biologischer Systeme und entwickelt lichtresponsive Bausteine, Labels und Linker. Simeth schreibt im Wechsel mit Christopher Teskey den Blickpunkt Synthese in den Nachrichten.

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