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Trendberichte

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Chemische Proteinsynthese: Neue Techniken in der Durchflusschemie und selektive Ligationsmethoden erm&ouml;glichen, komplexe und pr&auml;zise modifizierte Peptide und Proteine f&uuml;r biologische Anwendungen herzustellen. Funktionelle Charakterisierung: Mit Methoden aus Mikrobiologie, chemischer Biologie und Biochemie untersuchen Forschende die molekulare Funktion bakterieller Enzyme des Mikrobioms und decken so deren Relevanz bei der Entwicklung von Darmerkrankungen auf. DNA-Origami: Biomolek&uuml;le auf mikro- und nanoskopischer Ebene zu untersuchen soll helfen, neue Therapeutika zu entwickeln, herzustellen und an ihren Zielort zu bringen. Besonders die Interaktionen von Proteinen miteinander und mit Ligandenmolek&uuml;len sind dabei wichtig.
Trendbericht
<h2 type="main">Funktionelle Charakterisierung der Darmflora und ihrer hydrolytisch aktiven Enzyme</h2>
Das menschliche Darmmikrobiom ist eine Gemeinschaft aus Billionen von Mikroorganismen, die die menschliche Gesundheit direkt beeinflusst. In den letzten Jahren wurden verbl&uuml;ffende Korrelationen zwischen einer ver&auml;nderten Zusammensetzung des Darmmikrobioms (Dysbiose) und Krankheiten wie Darmkrebs oder entz&uuml;ndlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease, IBD) nachgewiesen.1)
Diese Entdeckungen haben gro&szlig;es Interesse geweckt, das Darmmikrobiom f&uuml;r therapeutische Anwendungen zu modulieren. Die meisten der bekannten Zusammenh&auml;nge sind jedoch bisher rein beschreibend, und die molekularen Mensch-Mikrobiom-Wechselwirkungen sind weitgehend unverstanden. Die Funktion einzelner Enzyme der humanen Darmflora zu charakterisieren, k&ouml;nnte diese L&uuml;cke schlie&szlig;en.
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<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/VV4PXQcQIqWFdP4W0z51">
<figcaption><label>Abb.1: </label>a) Indem sie Substrate verarbeiten, modulieren mikrobielle Proteasen und andere Enzyme im Darm die Interaktionen zwischen einzelnen Mikroorganismen, der mikrobiellen Gemeinschaft und dem menschlichen Wirt. b) Chemische Strukturen aktivit&auml;tsbasierter Sonden und kovalenter Inhibitoren, mit denen die molekularen Funktionen von Hydrolasen des Darmmikrobioms untersucht wurden.</figcaption>
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<h2 type="main">Modulatoren des Mikrobioms und der Darmgesundheit</h2>
Proteasen, also Enzyme, die Peptidbindungen spalten, regulieren essenzielle biologische Prozesse und sind daher als molekulare Zielstrukturen f&uuml;r Arzneimittel etabliert. Auch im Darm haben sie wichtige Funktionen, die &uuml;ber den Nahrungsverdau hinausgehen: Studien haben eine &uuml;berm&auml;&szlig;ige Proteaseaktivit&auml;t mit Dysbiose und Darmerkrankungen wie IBD in Verbindung gebracht. M&ouml;gliche Mechanismen, wie Proteasen die Darmphysiologie beeinflussen, umfassen (Abbildung a):
<list>die Spaltung von Proteinen aus der Nahrung in Peptide und Aminos&auml;uren, damit Zellen diese aufnehmen k&ouml;nnen. Dies kann die Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften beeinflussen, da die prozessierten N&auml;hrstoffe auch anderen Mikroorganismen zur Verf&uuml;gung stehen.</list>2)<list><listitem></listitem>die proteolytische Ver&auml;nderung endogener Biomolek&uuml;le, von Bestandteilen der Ern&auml;hrung (beispielsweise Gluten), bioaktiver Metabolite oder von Arzneistoffen. Solche Metabolisierungen vermitteln mikrobielle Wechselwirkungen,</list>3)<list><listitem> wie sie auch im Darm vorkommen.</listitem><listitem>die direkte Interaktion mit anderen Mikroorganismen oder dem menschlichen Wirt durch Proteolyse zellul&auml;rer Proteine. Das kann beispielsweise die Darmbarriere sch&auml;digen.</listitem></list>
<h2 type="main">Proteasenvermittelte Mechanismen</h2>
Um krankheitsmodulierende Bakterien zu identifizieren, werden klassischerweise klinische Studien durchgef&uuml;hrt. Diese untersuchen zum Beispiel die Stuhlproben von IBD-Patienten via DNA-Sequenzierung auf ver&auml;nderte bakterielle Zusammensetzungen. In ersten Studien lie&szlig;en sich hierbei auch genauere, durch Proteasen vermittelte Mechanismen aufkl&auml;ren. Wie das Team um Gonzalez mit mehreren Methoden zeigte, sind in IBD-Patienten Bakterien der Art Bacteroides vulgatus &uuml;berrepr&auml;sentiert, und ihre sekretierten Proteasen f&uuml;hren zur Dysfunktion der Darmbarriere, da sie deren Durchl&auml;ssigkeit erh&ouml;hen. Im Mausmodell l&ouml;ste die Kolonisierung mit diesen Bakterien starke Entz&uuml;ndungen aus, welche sich durch Gabe von Proteaseinhibitoren mindern lie&szlig;en. Die verantwortlichen Proteasen sind bisher nicht identifiziert.4)
Darmbakterien k&ouml;nnen zudem durch einzigartige Mechanismen die Aktivit&auml;t humaner Proteasen modulieren. Li und Coautor:innen isolierten aus Stuhlproben gesunder Menschen bisher kaum erforschte Bakterien der Gattung Paraprevotella, die das humane Verdauungsenzym Trypsin abbauen.5) Das geschieht, indem die Bakterien Trypsin an ihrer Zelloberfl&auml;che binden und so dessen Autoproteolyse induzieren, also seinen Selbstabbau. Werden M&auml;use mit Paraprevotella-Bakterien kolonisiert und wird damit die Trypsin-Aktivit&auml;t verringert, unterdr&uuml;ckt dies den Abbau von IgA-Antik&ouml;rpern im Darm und sch&uuml;tzt die Tiere so vor Hepatitis-Infektionen.5)
<h2 type="main">Fortschritte in der Kultivierung, zielgerichtete Untersuchungen</h2>
Statt komplexe Stuhlproben zu untersuchen, lassen sich auch einzelne Darmbakterien analysieren. Dieses Vorgehen wird immer wichtiger, um die Funktionen individueller Enzyme zu charakterisieren. Grundlagen hierf&uuml;r sind verbesserte Methoden zur (Hochdurchsatz-)Kultivierung unter anaeroben Bedingungen, wie sie im Darm zu finden sind. Mit diesen Fortschritten l&auml;sst sich beispielsweise in Mono- oder Cokulturen im Hochdurchsatz untersuchen, wie Arzneistoffe, die keine typischen Antibiotika sind, das bakterielle Wachstum beeinflussen.6) Einer umfangreichen Massenspektrometriestudie von Zimmermann und Coautor:innen zufolge werden viele Arzneistoffe f&uuml;r den Menschen insbesondere durch Bakterien der Gattung Bacteroidetes abgebaut, indem diese Ester- und Amidbindungen hydrolysieren. Eine solche Metabolisierung durch mikrobielle Proteasen oder andere Enzyme beeinflusst daher die aktiven Wirkstoffkonzentrationen im Menschen.7)
Direkt interagieren bakterielle Proteasen und menschliche Zellen beispielsweise dann, wenn eine Signal&uuml;bertragung durch humane Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs) stattfindet. Diese G-Protein-gekoppelten Rezeptoren kommen etwa in der Darmwand vor. Aktiviert oder deaktiviert werden sie, wenn eine Protease ein extrazellul&auml;res N-terminales Peptid des Rezeptors abschneidet. Hierdurch modulieren die Rezeptoren beispielsweise das Schmerzempfinden und die Durchl&auml;ssigkeit der Darmbarriere. Bei IBD-Patienten finden sich &uuml;berm&auml;&szlig;ige Proteolyse und PAR-Aktivierung, was die Erkrankung vermutlich mitverursacht. Wie erste Untersuchungen an den &Uuml;berst&auml;nden bakterieller Kulturen &ndash; die alle sekretierten Enzyme enthalten &ndash; nahelegen, k&ouml;nnen auch weit verbreitete, nichtpathogene Darmbakterien die Signal&uuml;bertragung humaner PARs beeinflussen, indem sie Proteasen abgeben.8) W&auml;hrend die einzelnen Proteasen noch nicht bekannt sind, ist eine Modulierung der bakteriellen Proteolyse zur Behandlung von IBD ein vielversprechender Ansatz.
<h2 type="main">Chemoproteomisch einzelne Enzyme charakterisieren</h2>
Es ist schwierig, die f&uuml;r die einzelnen Bioaktivit&auml;ten verantwortlichen Enzyme auszumachen. Trotz Fortschritten in der bioinformatischen Genomanalyse ist ein Gro&szlig;teil der bakteriellen Gene nicht charakterisiert, und es ist nicht trivial, die Funktionen der Proteine vorherzusagen, f&uuml;r die sie codieren. Zudem ist es bei vielen Darmbakterien immer noch aufwendig oder gar unm&ouml;glich, genetische Mutanten herzustellen, die R&uuml;ckschl&uuml;sse auf Mechanismen zulassen.
Die Proteolyse ist hochgradig reguliert und fein abgestimmt. Daher bedarf es neuer Werkzeuge, um die katalytische Aktivit&auml;t und die Substrate einzelner Proteasen in mikrobiellen Umgebungen zu untersuchen und deren Einfluss auf die menschliche Gesundheit besser zu verstehen.
Vielversprechende L&ouml;sungen hierf&uuml;r sind chemoproteomische Methoden, etwa das aktivit&auml;tsbasierte Protein-Profiling (activity-based protein profiling, ABPP). ABPP nutzt chemische Sonden, die nukleophile Aminos&auml;urereste von Proteinen kovalent modifizieren. Die so markierten Proteine werden bei Konjugation mit Fluorophoren sichtbar oder bei Konjugation mit Affinit&auml;tsgruppen wie Biotin nach Anreicherung massenspektrometrisch identifizierbar. Reaktivit&auml;t und Selektivit&auml;t der chemischen Sonden werden durch deren molekulares Design moduliert, sodass entweder ganze Enzymfamilien (etwa Serinhydrolasen) oder einzelne Proteine adressierbar werden. ABPP erm&ouml;glicht dadurch, endogene Enzymaktivit&auml;ten direkt in komplexen Proteomen zu messen, wie etwa jene bakterieller Gemeinschaften.
Cravatt hat im Jahr 1999 erstmals chemoproteomisch Fluorophosphonatsonden eingesetzt, die die Aminos&auml;ure Serin im aktiven Zentrum von Serinhydrolasen kovalent modifizieren.9) Keller und Kolleg:innen analysierten damit die zellul&auml;ren Serinhydrolasen des weit verbreiteten Darmbakteriums Bacteroides thetaiotaomicron (Abbildung b). Massenspektrometrisch identifizierten sie zwei bakterielle Homologe der humanen Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4), einem Protein, das angesteuert wird, um Diabetes zu behandeln. Demnach hemmen therapeutisch zugelassene DPP4-Inhibitoren auch die bakteriellen DPP4-Homologe und beeinflussen so die Zusammensetzung der Darmflora.10)
Das von bestimmten Escherichia-coli-St&auml;mmen produzierte Genotoxin Colibactin steht im Verdacht, die Entwicklung von Darmkrebs zu f&ouml;rdern. Um das Toxin freizusetzen, nutzt das Bakterium die d,l-Peptidase ClbP. Diese schneidet einen Teil eines inaktiven Vorl&auml;uferpeptids ab und aktiviert es dadurch. F&uuml;r mechanistische Untersuchungen und als potenzielles Therapeutikum entwickelte das Team um Balskus Borons&auml;urederivate (Abbildung b, Seite 59). Diese binden kovalent an ClbP, hemmen es dadurch und unterdr&uuml;cken so die Toxinproduktion.11)
<h2 type="main">Chemische Sonden</h2>
Neben Proteasen lassen sich weitere hydrolytisch aktive Enzyme der Darmflora durch chemische Sonden untersuchen. Changs und Devlins Gruppen synthetisierten Acyloxymethylketon(AOMK)- und Fluormethylketon(FMK)-Derivate der Chols&auml;ure (Abbildung b) als chemische Sonden und kovalente Inhibitoren. Mit diesen verfolgten und inhibierten sie die Aktivit&auml;t von Gallens&auml;urehydrolasen in bakteriellen Kulturen und in M&auml;usen.12,13) Diese Enzyme sind verantwortlich f&uuml;r die Produktion sekund&auml;rer Gallens&auml;uren. Die Wichtigkeit dieser Enzyme f&uuml;r die menschliche Gesundheit wird immer deutlicher &ndash; daher sind Werkzeuge wichtig, mit denen sich ihre Aktivit&auml;t regeln l&auml;sst.14)
Das Team um Redinbo nutzte ABPP, um diejenigen Enzyme auszumachen, die bei der Behandlung mit dem Krebsmedikament Irnotecan f&uuml;r Nebenwirkungen im Magen-Darm-Trakt verantwortlich sind. Der Arzneistoff wird im Rahmen des Phase-II-Metabolismus durch Konjugation mit Glucurons&auml;ure inaktiviert und dann &uuml;ber den Darm ausgeschieden. Hier k&ouml;nnen bakterielle &beta;-Glucuronidasen das Konjugat jedoch zur&uuml;ck zum aktiven Wirkstoff transformieren, der die Darmwand sch&auml;digt. Die Forschungsgruppe quantifizierte mit kovalenten Aziridinsonden (Abbildung b, S. 59) die &beta;-Glucuronidase-Aktivit&auml;ten in Stuhlproben und identifizierte die verantwortlichen Enzyme verschiedener Bakterien per Massenspektrometrie.15)
Interdisziplin&auml;re mechanistische Untersuchungen, die die St&auml;rken naturwissenschaftlicher Fachrichtungen kombinieren, er&ouml;ffnen der Mikrobiomforschung eine Perspektive: bakterielle Schl&uuml;sselenzyme zu identifizieren, welche die humane Gesundheit direkt beeinflussen. Diese Entdeckungen k&ouml;nnten durch zielgerichtete Wirkstoffkampagnen neue Hoffnung geben, dass bisher schwer therapierbare Krankheiten wie IBD heilbar werden.
Julian Seidel,
Markus Lakemeyer,
Universit&auml;t Jena
<a href="mailto:markus.lakemeyer@uni-jena.de">markus.lakemeyer@uni-jena.de</a>
<h2 type="main">Drei Fragen an den Autor: Markus Lakemeyer</h2>
Welche Methode wurde in den letzten zw&ouml;lf Monaten vermehrt genutzt, die auch Sie f&uuml;r Ihre Forschung brauchen?
Immer mehr Forschungsgruppen nutzen Methoden der chemischen Proteomik, sicherlich auch dank optimierter Protokolle zur Probenvorbereitung und verbesserter Software zur einfachen Datenauswertung.
Was brauchen Sie heute im Beruf, was Sie im Studium nicht gelernt haben?
Die F&auml;higkeit zum Multitasking &ndash; insbesondere, wenn es darum geht, neben der wissenschaftlichen Arbeit in Forschung und Lehre alle administrativen Aufgaben nicht zu vernachl&auml;ssigen.
Ihre Forschung in 140 Zeichen?
Wir kombinieren organische Synthese, Mikrobiologie und Proteomik, um die molekularen Mechanismen mikrobieller Interaktionen aufzukl&auml;ren.
Markus Lakemeyer leitet seit 2022 eine Nachwuchsgruppe an der Universit&auml;t Jena. Nach dem Chemiestudium in Aachen und Marburg promovierte er zu chemischer Biologie an der TU M&uuml;nchen. Anschlie&szlig;end war er Postdoktorand an der Stanford University. Seit 2024 wird er durch das Emmy-Noether-Programm der DFG gef&ouml;rdert. Bei diesem Artikel unterst&uuml;tzte ihn sein Postdoktorand Julian Seidel. Er entwickelt neuartige kovalente Sonden, um bakterielle Hydrolasen zu untersuchen. Er studierte Chemie und Biochemie in T&uuml;bingen und promovierte im Jahr 2022 zur Entwicklung peptidbasierter Sonden f&uuml;r Histondeacetylasen.<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/k6uLhxlTmafmBwm5c3p1"><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/bXhM1C8CRlSNjEaGFYBd">
<ul class="references" cited="no" xml:id="nadc20244143493-bibl-0001">
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0001">1 L. M. Proctor, H. H. Creasy, J. M. Fettweis et al., Nature 2019, 569, 641</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0002">2 V. R. Marcelino, C. Welsh, C. Diener et al., Nat. Commun. 2023, 14, 6546</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0003">3 D. C. Flores, V. Hotter, T. Vuong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2024, 121, e2401632121</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0004">4 R. H. Mills, P. S. Dulai, Y. V&aacute;zquez-Baeza et al., Nat. Microbiol. 2022, 7, 262</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0005">5 Y. Li, E. Watanabe, Y. Kawashima, D. R. Plichta et al., Nature 2022, 609, 582</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0006">6 P. M&uuml;ller, J. de la Cuesta-Zuluaga, M. Kuhn et al., Nat. Protoc. 2024, 19, 668</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0007">7 M. Zimmermann, M. Zimmermann-Kogadeeva, R. Wegmann, A. L. Goodman, Nature 2019, 570, 462</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0008">8 J. L. Sessenwein, C. C. Baker, S. Pradhananga et al., J. Neurosci. 2017, 37, 11758</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0009">9 Y. Liu, M. P. Patricelli, B. F. Cravatt, Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, 96, 14694</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0010">10 L. J. Keller, T. H. Nguyen, L. J. Liu et al., Nat. Chem. Biol. 2023, 19, 1469</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0011">11 M. R. Volpe, J. A. Velilla, M. Daniel-Ivad et al., Nat. Chem. Biol. 2023, 19, 159</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0012">12 B. Parasar, H. Zhou, X. Xiao et al., ACS Cent. Sci. 2019, 5, 867</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0013">13 A. A. Adhikari, T. C. Seegar, S. B. Ficarro et al., Nat. Chem. Biol. 2020, 16, 318</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0014">14 B. Rimal, S. L. Collins, C. E. Tanes et al., Nature 2024, 626, 859</li>
<li xml:id="nadc20244143493-bib-0015">15 P. B. Jariwala, S. J. Pellock, D. Goldfarb et al., ACS Chem. Biol. 2019, 15, 217</li>
</ul>

Trendbericht

Funktionelle Charakterisierung der Darmflora und ihrerhydrolytisch aktiven Enzyme ‐Trendbericht Biochemie 2024 (2/3)

Chemische Proteinsynthese: Neue Techniken in der Durchflusschemie und selektive Ligationsmethoden erm&ouml;glichen, komplexe und pr&auml;zise modifizierte Peptide und Proteine f&uuml;r biologische Anwendungen herzustellen. Funktionelle Charakterisierung: Mit Methoden aus Mikrobiologie, chemischer Biologie und Biochemie untersuchen Forschende die molekulare Funktion bakterieller Enzyme des Mikrobioms und decken so deren Relevanz bei der Entwicklung von Darmerkrankungen auf. DNA-Origami: Biomolek&uuml;le auf mikro- und nanoskopischer Ebene zu untersuchen soll helfen, neue Therapeutika zu entwickeln, herzustellen und an ihren Zielort zu bringen. Besonders die Interaktionen von Proteinen miteinander und mit Ligandenmolek&uuml;len sind dabei wichtig.
Trendbericht
<h2 type="main">Chemische Proteinsynthese</h2>
In lebenden Organismen werden Proteine von Ribosomen aus den zwanzig kanonischen Aminos&auml;uren hergestellt. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung und Methylierung machen die Strukturen komplexer und werden oft durch Enzyme reguliert. Um Struktur, Dynamik und Interaktionen von Proteinen zu untersuchen, ist es unerl&auml;sslich, pr&auml;zise modifizierte Proteine herzustellen, die PTMs und andere chemische Modifikationen enthalten.
Proteine lassen sich durch rekombinante Expression &ndash; etwa mit einem erweiterten genetischen Code &ndash;, chemische Proteinsynthese oder Kombinationen beider Methoden ma&szlig;schneidern. Rekombinante Methoden liefern zwar Proteine jeder gew&uuml;nschten Gr&ouml;&szlig;e, aber es sind nicht beliebig viele vollst&auml;ndige und selektive Modifikationen m&ouml;glich, sodass sich nicht jedes Wunschprotein herstellen l&auml;sst. Die chemische Proteinsynthese hingegen erm&ouml;glicht, theoretisch unbegrenzt viele nicht-kanonische Aminos&auml;uren mit hoher Pr&auml;zision einzubauen und eignet sich somit, Proteine mit spezifischen PTM-Mustern herzustellen.
Chemisch entstehen Peptide &uuml;blicherweise im von Bruce Merrifield entwickelten Verfahren (solid-phase peptide synthesis, SPPS) an der Festphase. Einzelne Peptide werden &uuml;ber Ligationsverfahren wie die Native Chemical Ligation verkn&uuml;pft, bis die komplette Peptidsequenz des gew&uuml;nschten Proteins erreicht ist. Aufreinigung und Faltung liefern schlie&szlig;lich ein Protein, das f&uuml;r biophysikalische Assays und biologische Tests infrage kommt. Die Gr&ouml;&szlig;e der so zug&auml;nglichen Proteine ist jedoch begrenzt. Dies liegt teils an relativ kurzen (etwa 50 Aminos&auml;uren langen), per SPPS gewonnenen Peptidfragmenten, teils an den speziellen Reagenzien und Methoden, die f&uuml;r eine zunehmende Zahl von Ligationen erforderlich sind. Die hohe Sequenzabh&auml;ngigkeit der SPPS sowie die oft beobachtete geringe L&ouml;slichkeit bestimmter Peptidfragmente sind weitere Schwierigkeiten.
In den vergangenen Jahren wurden viele neue Ans&auml;tze verfolgt, um diese Probleme zu l&ouml;sen. Zudem dienten (semi-)synthetische Proteine in vielen F&auml;llen dazu, zum Beispiel PTM-abh&auml;ngige Protein-Protein-Interaktionen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Dieser Trendbericht pr&auml;sentiert eine Auswahl von Arbeiten seit dem Jahr 2021.
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<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/KApKZPC2TZCZK6R5Szrl">
<figcaption><label>Abb.1: </label>Ablauf der chemischen (Semi-)Synthese von Proteinen. In den letzten Jahren gab es bei jedem Schritt Neuerungen, die die Proteinsynthese schneller, effizienter und weniger sequenzabh&auml;ngig gestaltet haben.</figcaption>
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<h2 type="main">Durchflussbasierte Synthesemethoden</h2>
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) verwendet ein Harz mit schneidbarem Linker, an dem &uuml;ber abwechselnde Kopplungs- und Entsch&uuml;tzungsschritte das gew&uuml;nschte Peptid entsteht. SPPS ist ein Syntheseverfahren, dessen Entwicklung in den vergangenen Jahren vorangetrieben wurde: Sie soll beispielsweise nachhaltiger gestaltet werden, also weniger und vor allem weniger toxische Abf&auml;lle produzieren,1) und Peptide liefern, die l&auml;nger sind als bisher. Zudem sollen dabei weniger Nebenprodukte entstehen.
In den meisten F&auml;llen findet SPPS im Batch-Verfahren statt, beispielsweise via Mikrowellensynthese. Allerdings werden durchflussbasierte Verfahren wichtiger, denn sie bieten pr&auml;zise kontrollier- und reproduzierbare Reaktionsbedingungen und weniger Nebenreaktionen. Wie beispielsweise Pentelute und Mitarbeiter:innen zeigten, lassen sich mit automatisierter Durchflusschemie innerhalb weniger Stunden Peptide herstellen, die mehr als 160 Aminos&auml;uren lang sind.2) Mit diesem Verfahren entstanden unter anderem native Proteine (Lysozym, Barnase, Sortase A),2) posttranslational modifizierte MYC-Fragmente3) sowie etliche d-Proteine.4) (MYC ist ein Transkriptionsfaktor, der bei den meisten Krebsarten hochreguliert ist.)
Bei der Durchflusschemie entstehen nicht nur weniger Nebenprodukte, die Reaktion am Harz l&auml;sst sich au&szlig;erdem in Echtzeit verfolgen. Dies ist besonders wertvoll, da die Aminos&auml;uren abh&auml;ngig von der Sequenz schwierig zu koppeln sind &ndash; um das gew&uuml;nschte Peptid zu erhalten, muss dann die Synthesestrategie (meist arbeitsintensiv) optimiert werden. Die allgemein akzeptierte Hypothese: Diese schwierigen Peptide bilden &beta;-Faltbl&auml;tter und aggregieren auf dem Harz, was die Reaktionskinetik und die Diffusion der Reagenzien durch das Harz beeintr&auml;chtigt. Alle folgenden Kopplungen und Entsch&uuml;tzungen werden weniger effizient, was zu Nebenprodukten und geringen Syntheseausbeuten f&uuml;hrt. Mit Durchflusschemie und neuen Analyseverfahren l&auml;sst sich genau diese Aggregation beobachten und analysieren.5)
<h2 type="main">Neue Werkzeuge f&uuml;r die chemische Proteinsynthese</h2>
Neben der Festphasen-Peptidsynthese ist die Ligation ein Schl&uuml;sselschritt der chemischen Proteinsynthese. Eine der meistgenutzten Methoden ist die Native Chemical Ligation (NCL), an der ein N-terminaler Thioester sowie ein C-terminales Cystein beteiligt sind. Eine Variante dieser Methode ist die Diselenid-Selenoester-Ligation (DSL): Sie verl&auml;uft h&auml;ufig schneller und mit besseren Ausbeuten, da das beteiligte Selenocystein reaktiver ist als Cystein. Im Jahr 2021 ver&ouml;ffentlichten Payne und Mitarbeiter:innen eine Weiterentwicklung, die durch eine neue photospaltbare Schutzgruppe erm&ouml;glicht, mehrere Fragmente mit DSL iterativ zu koppeln.6) Wie sich in Zusammenarbeit mit Beckers Gruppe zeigte, eignet sich DSL au&szlig;erdem f&uuml;r die Expressed Protein Ligation, bei der ein synthetisches Peptid mit einem rekombinanten Peptid oder Protein ligiert wird. Vorteile der DSL dabei sind hier kurze Reaktionszeiten und die besonders milde, chemoselektive Photodeselenierung: Sie geschieht im w&auml;ssrigen Puffer unter Einwirkung von Licht.7)
Eine weitere Herausforderung in der chemischen Proteinsynthese: Hydrophobe Peptidfragmente l&ouml;sen sich nur schlecht in w&auml;ssrigen Puffern. Um die L&ouml;slichkeit zu erh&ouml;hen, werden reversible L&ouml;slichkeitstags verwendet, die in den letzten Jahren h&auml;ufig mit Ligationsmethoden kombiniert wurden. Li und Mitarbeiter:innen verbanden beispielsweise sowohl die Ser/Thr-Ligation als auch die Cys/Pen-Ligation mit reduzierbaren L&ouml;slichkeitstags &ndash; sowohl f&uuml;r die chemische Proteinsynthese als auch f&uuml;r die Protein-Semisynthese.8)
Unsere Gruppe hat einen Synthesetag (SynTag) entwickelt, der w&auml;hrend der Synthese die Peptidfaltung am Harz vermindert und somit die Reinheit der synthetisierten Peptide erh&ouml;ht.9) Wie sich zeigte, erzielt eine Kombination aus Pbf-gesch&uuml;tzten Argininen und einem schneidbaren MeDbz-Linker (Dawson-Linker) hierbei den besten Effekt (Pbf: (2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl); MeDbz: 3-Amino-4-(methylamino)benzoes&auml;ure). Positive Nebeneffekte dieses SynTags: Nach Entsch&uuml;tzen und Schneiden vom Harz macht er das Peptid besser wasserl&ouml;slich, und der MeDbz-Linker macht ihn vielf&auml;ltig einsetzbar. So l&auml;sst sich der SynTag zur nativen C-terminalen Carbons&auml;ure hydrolysieren; er eignet sich aber auch als Aktivester in der Ligation. So lie&szlig; sich mit SynTag zum Beispiel erstmals die Transaktivierungsdom&auml;ne von MYC mit einer einzigen Native Chemical Ligation synthetisieren. G&auml;ngige Synthesemethoden waren hier nicht erfolgreich, denn eines der Ligationsfragmente aggregierte nicht nur w&auml;hrend der Synthese, sondern war zus&auml;tzlich schwer in w&auml;ssrigen Puffern l&ouml;slich.
Nach Synthese und Aufreinigung der Proteine ist der letzte wichtige Schritt der Proteinsynthese die Proteinfaltung. Viele Proteine enthalten eine oder mehrere Disulfidbr&uuml;cken, die selektiv unter oxidativen Bedingungen gebildet werden m&uuml;ssen. Gerade bei Proteinen mit mehreren Disulfidbr&uuml;cken kann dieser schrittweise Prozess sehr zeitaufw&auml;ndig sein. Im Jahr 2021 zeigten Brik und Mitarbeiter:innen eine generell anwendbare und schnelle Methode, mit der sich mehrere Disulfidbr&uuml;cken kn&uuml;pfen lassen. Sie kombiniert Entsch&uuml;tzungsstrategien (kleine Molek&uuml;le, ultraviolettes Licht und palladiumvermittelte Reaktionen) und f&uuml;hrt so zu einer chemo- und regioselektiven Cystein-Aktivierung.10) Den Nutzen ihrer Strategie demonstrierte die Gruppe, indem sie Proteine wie den Trypsininhibitor EETI-II und ein Conotoxin &ndash; ein Toxin aus dem Gift von Meeresschnecken &ndash; herstellte.
<h2 type="main">Mit (semi-)synthetischen Proteinen biologische Fragen kl&auml;ren</h2>
(Semi-)Synthetische Proteine dienen h&auml;ufig dazu, die Interaktion und Struktur von Proteinen aufzukl&auml;ren, und es lassen sich immer l&auml;ngere Proteine synthetisieren. Im Jahr 2021 publizierten Payne und Mitarbeiter:innen die Synthese des phosphorylierten Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 (IGFBP-2).11) Das 31,5 kDa gro&szlig;e Protein entstand hierbei in insgesamt sieben Ligationsschritten (DSL und NCL) aus acht Peptidfragmenten. In IGF-I-Bindungsassays untersuchte die Gruppe anschlie&szlig;end in vitro, wie die Phosphorylierung die Protein-Protein-Interaktion beeinflusst.
Neben komplett synthetisch hergestellten Proteinen gab es Anwendungen auf dem Gebiet der Protein-Semisynthese. Becker und Bello beispielsweise zeigten im Jahr 2022 die Semisynthese von vier Granulocyte-Colony-Stimulating-Factor(G-CSF)-Proteinen mit unterschiedlichen Glykosylierungsmustern und demonstrierten deren biologische Aktivit&auml;t in Zellproliferationsassays.12) M&ouml;glich wurde die Synthese durch einen neuen photospaltbaren Polyethylenglykol(PEG)-Linker, der die Glykosylierungsausbeuten erh&ouml;hte, sowie Selen-basierten Ligationsmethoden.
Phosphorylierungen und Ubiquitinierungen sind weitere wichtige posttranslationale Modifikationen, die sowohl Struktur als auch Interaktionen mit anderen Proteinbindungspartnern beeinflussen. Beispielsweise stellten Liu, Kobilka, Zheng und Mitarbeiter:innen semisynthethisch den &beta;2-adrenergen Rezeptor (&beta;2AR) her, ein G-protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR), indem sie NCL und enzymatische Ligation kombinierten.13) Der Rezeptor bindet das Hormon Adrenalin und ist ein bedeutendes therapeutisches Ziel f&uuml;r Atemwegserkrankungen wie Asthma. Semisynthetisch wurden mehrere (poly-)phosphorylierte und ubiquitinierte &beta;2AR-Proteine hergestellt, um Unterschiede im Bindungsverhalten zu Proteinen zu untersuchen, welche die intrazellul&auml;ren Signalwege beeinflussen k&ouml;nnten.
Der immer schnellere und routiniertere Zugang zu modifizierten Proteinen wird es erm&ouml;glichen, den Fokus k&uuml;nftig von der Synthese auf die Beantwortung biologischer Fragen zu verlagern.
<h2 type="main">Drei Fragen an die Autorin: Nina Hartrampf</h2>
Ihre Forschung in 140 Zeichen?
Wir entwickeln Methoden und Techniken, um posttranslational modifizierte Proteine zur Beantwortung biologischer Fragen zu synthetisieren.
In welchem Gebiet erwarten Sie in den n&auml;chsten zw&ouml;lf Monaten die gr&ouml;&szlig;ten Entwicklungen und warum?
Bei der immer besseren computergest&uuml;tzten Vorhersage von Proteinstruktur und -funktion anhand der Sequenz. Dies wird voraussichtlich rationale Proteindesign und medizinische Anwendungen stark beeinflussen.
Was brauchen Sie heute im Beruf, was Sie im Studium nicht gelernt haben?
Als Studentin habe ich untersch&auml;tzt, wie facettenreich der Beruf ist. Er vereint nicht nur Forschung und Lehre, sondern auch Projektmanagement, Finanzplanung sowie das Ausbilden und F&ouml;rdern junger Forscher:innen. Das alles macht den Beruf anspruchsvoll, aber extrem spannend und abwechslungsreich.
Nina Hartrampf forscht seit 2020 als Assistenzprofessorin (Tenure Track) an der Universit&auml;t Z&uuml;rich. Zuvor promovierte sie bei Dirk Trauner zu Naturstoffsynthese und arbeitete bei Brad Pentelute am Massachusetts Institute of Technology an Flow-Peptidchemie.<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/5zJHbX0GS9m96AcA260q">
<ul class="references" cited="no" xml:id="nadc20244143478-bibl-0001">
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<li xml:id="nadc20244143478-bib-0009">9 H. B&uuml;rgisser, E. T. Williams, R. Lescure, A. Premanand, A. Jeandin, N. Hartrampf, ChemRxiv 2023, doi: <accessionid ref="info:doi/10.26434/chemrxiv-2023&ndash;7mz2c">10.26434/chemrxiv-2023&ndash;7mz2c</accessionid></li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0010">10 S. Laps, F. Atamleh, G. Kamnesky, H. Sun, A. Brik, Nat. Commun. 2021, 12, 870</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0011">11 B. Premdjee, A. S. Andersen, M. Larance, K. W. Conde-Frieboes, R. J. Payne, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 5336</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0012">12 L. Kerul, M. Schrems, A. Schmid et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202206116</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0013">13 Y. Li, J. Heng, D. Sun et al., J. Am. Chem. Soc. 2021, 143(42), 17566</li>
</ul>

Chemische Proteinsynthese/Trendbericht Biochemie 2024 (1/3)

Chemische Proteinsynthese: Neue Techniken in der Durchflusschemie und selektive Ligationsmethoden erm&ouml;glichen, komplexe und pr&auml;zise modifizierte Peptide und Proteine f&uuml;r biologische Anwendungen herzustellen. Funktionelle Charakterisierung: Mit Methoden aus Mikrobiologie, chemischer Biologie und Biochemie untersuchen Forschende die molekulare Funktion bakterieller Enzyme des Mikrobioms und decken so deren Relevanz bei der Entwicklung von Darmerkrankungen auf. DNA-Origami: Biomolek&uuml;le auf mikro- und nanoskopischer Ebene zu untersuchen soll helfen, neue Therapeutika zu entwickeln, herzustellen und an ihren Zielort zu bringen. Besonders die Interaktionen von Proteinen miteinander und mit Ligandenmolek&uuml;len sind dabei wichtig.
<h2 type="main">DNA-Origami in der Biomedizin</h2>
Eine Immunantwort erfordert eine koordinierte Kommunikation zwischen verschiedenen Partnern, etwa Immunzellen. Diese Antwort vermitteln Zellrezeptoren. Binden Liganden an die Rezeptoren, lagern diese sich zusammen und initiieren Signaltransduktionswege. Diese aktivieren zellul&auml;re Effektorfunktionen. Wie Rezeptoren, Corezeptoren und Adh&auml;sionsmolek&uuml;le zusammengesetzt und r&auml;umlich angeordnet sind, reguliert St&auml;rke und Qualit&auml;t der Signaltransduktion.
Letztlich bestimmt die Regulation einer solchen Signaltransduktion, ob Krankheiten wie eine HIV-Infektion, Autoimmunerkrankungen oder Krebs &uuml;berhaupt entstehen und, wenn ja, deren Ausma&szlig;. Da schon nanoskalige Unterschiede in der Ligandenanordnung zu zellul&auml;ren Reaktionen f&uuml;hren, ist es wichtig, diese Anordnungen zu kontrollieren. Nur so lassen sich deren Auswirkungen auf die Zielzelle untersuchen.
Sind die Rezeptoren und deren Cluster verstanden, lassen sich Wirkstoffe entwickeln, die entweder genau das tun, was eine gesunde Zelle t&auml;te, oder die gezielt kranke Zellen abt&ouml;ten.
Es gibt bisher nur wenige M&ouml;glichkeiten zu beeinflussen, wie sich Molek&uuml;le im Nanobereich anordnen. Eine davon ist die DNA-Nanotechnik, genauer DNA-Origami, im Jahr 2006 von Paul Rothemund entwickelt.1) Dabei wird eine lange einzelstr&auml;ngige DNA (Scaffold) mit hunderten, etwa 42 Nukleotid kurzen synthetisch hergestellten Oligonukleotiden (Staples) &uuml;ber die Franklin-Watson-Crick-komplement&auml;re Basenpaarung zusammengebracht. So lassen sich 2- oder 3-D-nanoskalige Strukturen ma&szlig;schneidern (Abbildung a).
<figure xml:id="nadc20244143343-fig-0001">
<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/w1IMYddZSwCsrsLw2a2X">
<figcaption><label>Abb.1: </label>a) Faltung und Funktionalisierung von DNA-Origami-Strukturen. b) Gezielte Anordnung von Gastmolek&uuml;len auf oder in einem DNA-Origami. Gastmolek&uuml;le sind etwa Proteine, synthetische Liganden, kurze, einzel- oder doppelstr&auml;ngige Ribonukleins&auml;ure-Molek&uuml;le von 20 bis 25 Basenpaaren L&auml;nge (small interfering RNA, siRNA) oder das cytostatisch wirksame Antibiotikum Doxorubicin.15)</figcaption>
</figure>
</figure>
Position und Sequenz jedes Staples sind bekannt. Das erlaubt, die Stapel an bestimmten Positionen zu verl&auml;ngern und so als Ankerpunkte zu nutzen, um Gastmolek&uuml;le zu binden. Dies erm&ouml;glicht nicht nur, die Strukturen st&ouml;chiometrisch zu beladen, sondern auch, Wirkstoffe kontrolliert freizusetzen (Abbildung b).
<h2 type="main">Ligand-Rezeptor-Interaktionen: Krebs</h2>
Aufgrund ihrer pr&auml;zisen Modifikationsm&ouml;glichkeiten eignen sich DNA-Origami-Strukturen, um geometrie- und distanzabh&auml;ngige Protein-Liganden-Interaktionen zu untersuchen. Denn es lassen sich gleichzeitig die genaue Zahl der Liganden, die Inter-Liganden-Distanz und die geometrische Anordnung kontrollieren, und zwar genauer als mit allen anderen Methoden.
Die ersten Berichte &uuml;ber kontrollierte Ligandenanordnung auf DNA-Origami handeln haupts&auml;chlich von Krebs. Sie untersuchten beispielsweise, wie der Abstand von Ephrin-A5-Liganden die Aktivierung des EphA2-Rezeptors bei Brustkrebs beeinflusst:2)
Mit einem st&auml;bchenf&ouml;rmigen DNA-Origami wurden die Ephrin-Liganden in Abst&auml;nden von 40 oder 100 nm angeordnet. Zellen, die Liganden mit einer Distanz von 40 nm ausgesetzt waren, waren st&auml;rker rezeptorphosphoryliert sowie weniger invasiv als solche, die Liganden mit einem Abstand von 100 nm oder einem monomeren Liganden ausgesetzt waren.
Wie eine andere Studie zeigte, beeinflusst nicht nur der Inter-Liganden-Abstand die Signalwegaktivierung in Krebszellen, sondern auch die geometrische Anordnung der Liganden.3) Die Autoren banden Fas-Liganden, welche sich in der Natur auf den Oberfl&auml;chen cytotoxischer T-Zellen befinden, an ein DNA-Origami. Wie sich zeigte, aktivieren die Liganden die Signalwege nur dann effizient, wenn sie in einer hexagonalen Anordnung pr&auml;sentiert werden, in der sie etwa 10 nm voneinander entfernt sind.
Nanoskalige &Auml;nderungen in der Liganden-Pr&auml;sentation beeinflussen also die Krebsentwicklung &ndash; eine wichtige Erkenntnis, um Therapeutika zu entwickeln.
<h2 type="main">B- und T-Zellen</h2>
Nicht nur Krebs h&auml;ngt davon ab, wie Liganden angeordnet sind. In immunologischen Prozessen gibt DNA-Origami Aufschluss dar&uuml;ber, wie sich Immunzellen aktivieren lassen. Einer Studie zufolge wirkt sich die r&auml;umliche Anordnung des HIV-1-Antigens EOD-GT8&ndash; auf die Aktivierung des B-Zell-Rezeptors aus.4) Indem sie die Calcium-Signalgebung als Indikator f&uuml;r die Reaktion der B-Zellen auslasen, stellten die Autoren fest: Das Calciumsignal nimmt zu, wenn das Antigen in einer Linie auf einem st&auml;bchenf&ouml;rmigen Origami angeordnet wird. Bei einer Inter-Liganden-Distanz von zirka 28 nm wird ein Plateau erreicht &ndash; gr&ouml;&szlig;ere Abst&auml;nde verringern die Rezeptoraktivierung. Dieser Trend bleibt bei der 3-D-Anordnung auf einem ikosaedrischen DNA-Origami erhalten (Abbildung b). Die Signalst&auml;rke steigt mit der Zahl der Antigene, bevor sie bei etwa f&uuml;nf Antigenen pro Struktur ein Plateau erreicht. Es sind also sowohl die Valenz als auch die Distanz zwischen den Liganden entscheidend bei der B-Zell-Aktivierung.
Bei T-Zellen zeigte sich unter Nutzung eines DNA-Origamis etwas &auml;hnliches: Die genaue nanoskalige Anordnung des PD-L1-Liganden &ndash; ein Suppressor der T-Zell-Signalgebung &ndash; ist wichtig f&uuml;r die Rezeptor-Inaktivierung und wirkt sich auf das Clustern von Rezeptoren aus.5) Demnach inaktivieren nur PD-L1-Abst&auml;nde von zirka 200 nm T-Zell-Rezeptoren, kleinere Abst&auml;nde nicht.
Ein weiterer Durchbruch gelang in einer Studie, die 105 Antik&ouml;rper-Quadrupel mit DNA-Origami screente. Mit diesen Quadrupeln sollten T-Zellen aktiviert und die T-Zell-spezifische Lyse verschiedener Zielzelllinien erm&ouml;glicht werden.6) Mit DNA-Origami lassen sich schneller bi- und multispezifische Anitk&ouml;rper herstellen, screenen und auf Effizienz testen als mit anderen Methoden wie De-novo-Proteindesign.
<h2 type="main">Makrophagen und dendritische Zellen</h2>
Neben B- und T-Zellen sind Makrophagen wichtig bei der Immunantwort, besonders bei der kontrollierten Phagozytose. Makrophagen lassen sich unter anderem durch CpG-Motive aktivieren, also durch nichtmethylierte, einzelstr&auml;ngige DNA-Sequenzen, die ein Cytosin(C)&ndash;Phosphat(p)&ndash;Guanosin(G)-Dinukleotid enthalten. Damit der Toll-like-Rezeptor 9 (TLR9) in Makrophagen durch CpG-Motive mit unterschiedlichen Distanzen, angeordnet auf einem DNA-Origami, aktiviert wird, sind mindestens zwei CpG-Motive mit einem Abstand von zirka 7 nm n&ouml;tig. Gr&ouml;&szlig;ere Abst&auml;nde reduzieren die Rezeptoraktivierung. Sowohl die Zahl der CpG-Kopien als auch die r&auml;umliche Organisation tragen zum Ausma&szlig; der TLR9-Signalgebung bei.7,8)
TLRs aktivieren durch CpG-Motive auch dendritische Zellen. In-vitro-Zellkulturstudien und In-vivo-Tumorbehandlungsmodellen zufolge f&ouml;rdert DNA-Origami, dekoriert mit CpG-Motiven im Abstand von 3,5 nm, einige Prozesse: die Aktivierung dendritischer Zellen, die Antigenkreuzpr&auml;sentation, die Aktivierung von CD8-T-Zellen (die infizierte oder kranke Zellen abt&ouml;ten), die Th1-polarisierte CD4-Aktivierung (CD4-T-Helferzellen sind an der Immunantwort beteiligt und veranlassen beispielsweise die Bildung von Abwehrstoffen gegen Krankheitserreger oder Pathogene) und die Aktivierung nat&uuml;rlicher Killerzellen (die Krebs- oder andere ver&auml;nderte Zellen erkennen und zerst&ouml;ren). Insgesamt aktiviert das Origami also drei wichtige Immunzellen (T-Zellen, T-Helferzellen, die dann auch B-Zellen aktivieren, und Killerzellen) und ruft so gezielt und h&ouml;chst effizient eine Immunantwort hervor.
Somit eignet sich Origami als Impfstoff, der nicht nur synergistisch mit Anti-PD-L1 die Krebsimmuntherapie in Melanom- und Lymphommodellen verbessert, sondern auch ein langfristiges T-Zell-Ged&auml;chtnis induziert. Den Ergebnissen dieser Studie zufolge k&ouml;nnte DNA-Origami als Plattform dienen, um den Adjuvansabstand &ndash; also den lokalen physischen Abstand der Antigene &ndash; zu kontrollieren und Antigene in Impfstoffen bereitzustellen.
<h2 type="main">Auf dem Weg zu neuen Therapeutika</h2>
DNA-Origami eignet sich als Therapeutikum, indem es funktionale Makromolek&uuml;le liefert oder bestimmte Proteine ausschaltet.
Hierzu wird das Wirkstoffmolek&uuml;l meist in ein hohles DNA-Origami eingebaut. Dieses &ouml;ffnet sich, wenn ein Zielmolek&uuml;l anwesend ist, und gibt seine Ladung frei (Abbildung b). Das nutzte eine Studie, um eine DNA-Origami-Struktur mit Gerinnungshemmer gegen Thrombose zu entwickeln. Indem die Autoren eine Hohlzylinderstruktur entwarfen, die sich nur bei erh&ouml;hter Thrombinkonzentration &ouml;ffnet, lie&szlig; sich blutgerinnselaufl&ouml;sender Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) an den Wunschort bringen und dosieren.9)
DNA f&auml;ngt sowohl reaktive Sauerstoffspezies als auch Stickoxide ab und wirkt so als Antioxidationsmittel. Das k&ouml;nnen auch DNA-Origamistrukturen, sodass sie ohne weitere Wirkstoffe als Therapeutikum Anwendung finden. Ein erster Durchbruch gelang in der Behandlung akuter Nierensch&auml;den:10) Origamistrukturen reicherten sich, abh&auml;ngig von ihrer Form, spezifisch in den Nieren an. Dort beseitigten sie reaktive Sauerstoffspezies, was nierensch&uuml;tzend wirkt. Diese formabh&auml;ngige Akkumulierung von Nanostrukturen in bestimmten Organen ist bekannt. Nun kann die Form eines Origamis auch dazu dienen, gr&ouml;&szlig;ere Pathogene einzufangen &ndash; ikosaedrische Halbschalenstrukturen mit virus&auml;hnlichen Gr&ouml;&szlig;en etwa binden Viren wie Hepatitis-B-Viren oder Adenoviren und machen sie so unsch&auml;dlich.11)
Neben der M&ouml;glichkeit, virale Infektionen zu behandeln, lieferte diese Studie wirtschaftliche und effektive DNA-basierte Nanoplattformen, mit denen sich Arzneimittel, Gene oder immunstimulierende Komponenten verabreichen lassen.
<h2 type="main">Schutzstrategien</h2>
Eines der gr&ouml;&szlig;ten Probleme bei der Verwendung von DNA-Origami als Wirkstofftr&auml;ger: Ungesch&uuml;tzte DNA-Origamistrukturen sind in biologischen Medien instabil. Die Haltbarkeit einer DNA-Origamistruktur in Pr&auml;senz von Nukleasen betr&auml;gt, je nach Struktur, einige Stunden. Dem l&auml;sst sich entgegenwirken, etwa durch &Uuml;berziehen (Coaten) mit PEG-Oligolysin12) und anderen Polymeren, oder indem die Struktur in Calciumphosphat oder Silika13) verkapselt wird. Trotz dieser Modifizierungen binden die Origamistrukturen weiterhin Gastmolek&uuml;le.
Solche Methoden erh&ouml;hen nicht nur die Stabilit&auml;t der Strukturen, sondern verringern oft auch die Immunantwort &ndash; dadurch wirken DNA-Origami bei systemischer Verabreichung durch Spritzen in den Blutkreislauf kaum cytotoxisch.14)
<h2 type="main">Drei Fragen an die Autorin: Amelie Heuer-Jungemann</h2>
Was w&uuml;rden Sie gerne entdecken oder herausfinden?
Ich w&uuml;rde wahnsinnig gerne eine Art Superpille entwickeln, mit der ein Organismus vor&uuml;bergehend neue Eigenschaften bekommt &ndash; zum Beispiel, dass Pflanzen selbst Stickstoff fixieren k&ouml;nnen. Sowas &auml;hnliches versuchen wir jetzt in meinem neuen ERC-Projekt NanoCat.
Was sind derzeit Ihre Hauptforschungsprojekte?
Zum einen der Einsatz von DNA-Origami in der Biomedizin, um Protein-Protein-Interaktionen zu verstehen, etwa in Bezug auf Krebs oder auch bei der Immunantwort nach Organtransplantationen. Und um DNA-Origami als Tr&auml;ger f&uuml;r Therapeutika zu etablieren. Zum anderen verwenden wir in Silika eingekapselte DNA-Origamistrukturen, um effiziente Enzymsysteme f&uuml;r die Biokatalyse zu entwickeln.
Was brauchen Sie heute im Beruf, was Sie im Studium nicht gelernt haben?
Alles um die Wissenschaft herum: Wie man eine Gruppe leitet, Forschungsantr&auml;ge stellt, Mittelverwaltung und so weiter &ndash; das ist learning by doing.
Amelie Heuer-Jungemann, Jahrgang 1987, ist seit August 2020 Emmy-Noether-Gruppenleiterin am Max-Planck-Institut f&uuml;r Biochemie. Sie studierte Chemie mit Biochemie an der Heriot-Watt University, Edinburgh, promovierte an der Southampton University in Biophysik und war Postdoktorandin an der LMU M&uuml;nchen.<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/CnxMzGHZQ3ePmaSiCp5w">
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</ul>

DNA‐Origami in der Biomedizin ‐ Trendbericht Biochemie 2024 (3/3)

Technische Chemie 2024

Zeitversetzte Laserpulse auf Molek&uuml;le verraten, wie photochemische Prozesse ablaufen &ndash; dabei sind konische Durchschneidungen entscheidend. Die kolloidale Nanochemie hat neue Materialklassen erschlossen, wie Nickelboride und fr&uuml;he &Uuml;bergangsmetalloxid-Katalysatoren, sowie Synthesen zu photolumineszenten III&ndash;V-Halbleitern verbessert. Mit maschinellem Lernen lassen sich am Rechner Proteine nicht mehr nur falten, sondern solche entwerfen, die nicht mit nat&uuml;rlichen Proteinen verwandt sind.
<h2 type="main">ChatGPT und Proteindesign: Neue Wege durch Deep Learning und generative Modelle</h2>
Deep-Learning-Methoden haben beim rechnerbasierten Proteindesign neue M&ouml;glichkeiten er&ouml;ffnet. Mit generativen Modellen lassen sich jetzt neue Proteine entwerfen, die Proteinen aus der Natur nur wenig &auml;hneln. So werden in Zukunft neue Enzyme, Impfstoffe oder Nanomaterialien m&ouml;glich.
<h2 type="main">Wieso Proteindesign?</h2>
Das Ziel von Proteindesign ist, ein Protein mit gew&uuml;nschter 3-D-Struktur herzustellen. Zum Beispiel wollen wir die aktive Tasche eines Enzyms designen oder ein Bindungsprotein entwerfen, dessen 3-D-Struktur wir kennen. Der n&auml;chste Schritt ist, eine Aminos&auml;urenkette zu entwerfen, die sich in die gew&uuml;nschte 3-D-Struktur faltet (Abbildung 8).
<figure xml:id="nadc20244143087-fig-0001">
<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/nq1qw9rKS4eJNR30Lg5G">
<figcaption><label>Abb.1: </label>Proteindesign: Entwicklung einer Aminos&auml;urensequenz, die sich in die gew&uuml;nschte 3-D-Struktur faltet. Proteinfaltung: Vorhersage der 3-D-Struktur aus einer bekannten Sequenz.</figcaption>
</figure>
</figure>
Dadurch lassen sich Enzyme erzeugen, die Reaktionen katalysieren, mit denen sich Industriechemikalien oder Arzneimittel produzieren lassen. F&uuml;r die Pharmaforschung ist auch das Design von Proteinen interessant, da mit hochspezifischen Bindungsproteinen Krankheiten wie HIV, Krebs oder Alzheimer behandelt werden.1) Aufgrund ihrer definierten Struktur dienen designte Proteine auch als Bausteine f&uuml;r Nanomaterialien.2) So wurden zum Beispiel Hybridmaterialien aus Nanopartikeln und Proteinen hergestellt.3) Sie haben Eigenschaften, die in der Natur nicht vorkommen und hei&szlig;en Metamaterialien. Sie sind in Superlinsen, Tarnkappen und Material mit anomaler Lichtbrechung enthalten.
Protein-Engineering verbessert bereits bekannte Proteine oder Enzyme, zum Beispiel macht es sie stabiler oder besser l&ouml;slich in organischen L&ouml;semitteln &ndash; teilweise mit herausragendem Erfolg: F&uuml;r ihre Arbeiten zur gerichteten Evolution von Enzymen erhielt Frances Arnold im Jahr 2018 den Nobelpreis f&uuml;r Chemie. Dieser Prozess ahmt im Labor die nat&uuml;rliche Evolution nach. Dazu werden die Proteine an zuf&auml;llig ausgew&auml;hlten Positionen mutiert. Ein Assay pr&uuml;ft die neuen Varianten auf Aktivit&auml;t.
<h2 type="main">Proteindesign und -faltung: Revolution mit Deep Learning</h2>
Neue Proteine oder Enzyme lassen sich am Rechner entwerfen &ndash; beispielsweise mit der Rosetta-Software, die von der Gruppe David Bakers an der Universit&auml;t Washington und anderen Forschungsgruppen in der ganzen Welt entwickelt wird.4) Diese Software verwendet eine Energiefunktion, die verschiedene Wechselwirkungen in Proteinen abbildet. Im Verlauf des Designprozesses wird die Energie gesenkt. Hier gibt es etliche Beispiele f&uuml;r erfolgreiches Design, zum Beispiel eine Diels-Alderase, also ein Enzym f&uuml;r Diels-Alder-Reaktionen,5) und ein Bindungsprotein f&uuml;r den Interleukin-2-Rezeptor6).
Die in silico entworfenen Proteine und Enzyme sind aber entweder relativ nah verwandt mit vorhanden Proteinstrukturen oder zeigen nur geringe Aktivit&auml;t, die beispielsweise mit gerichteter Evolution zu verbessern ist. Um Proteine und Enzyme de novo, also ohne Verwandtschaft herzustellen, enthalten Methoden seit einigen Jahren Deep Learning.
Um Proteindesign zu verstehen, lohnt sich ein Blick vom Ergebnis aus, also der Proteinfaltung. Dabei m&ouml;chte man verstehen, wie sich aus einer bekannten Proteinsequenz die 3-D-Struktur eines Proteins bildet. Um diese Struktur aufzukl&auml;ren, waren bisher Experimente n&ouml;tig, darunter Proteinkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie. Im Jahr 2020 revolutionierte die Software AlphaFold2 von Deepmind das Feld: Die Software sagt verl&auml;sslich 3-D-Proteinstrukturen vorher.7)
AlphaFold2 verwendet Deep-Learning-Methoden und wurde mit bekannten, experimentell ermittelten Proteinstrukturen trainiert. Sp&auml;ter machte ChatGPT (Generative Pre-trained Transformer) die M&ouml;glichkeiten von Deep Learning bekannter. Inzwischen unterst&uuml;tzen Deep-Learning-Methoden nicht nur bei der Proteinfaltung, sondern auch beim Proteindesign.
F&uuml;r nat&uuml;rliche Proteine gibt es nur etwa zweitausend Faltungsmuster, sodass in der Natur nicht alle Faltungsm&ouml;glichkeiten realisiert werden. Mit generativen Modellen lassen sich daher 3-D-Strukturen entwickeln, die das nat&uuml;rliche Repertoire erweitern.
<h2 type="main">Halluzinieren: gut oder schlecht?</h2>
Generative Modelle wie ChatGPT erfinden vermeintliche Fakten &ndash; zum Beispiel Publikationen. Hierf&uuml;r wird der Begriff Halluzination verwendet. Bei ChatGPT mahnt dies zu besonderer Vorsicht, aber beim Proteindesign kann es zu neuen Strukturen f&uuml;hren. So verwendeten Forschende AlphaFold2, um aus einer frei gew&auml;hlten Proteinsequenz die dazugeh&ouml;rigen Strukturen vorherzusagen. Das Ziel waren cyclische Protein-Oligomere, die aus neu gefalteten Untereinheiten bestehen sollten (Abbildung 9).8)
<figure xml:id="nadc20244143087-fig-0002">
<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/8ToBwAe4QmOJ6B5biVBF">
<figcaption><label>Abb.2: </label>Neue Protein-Oligomere, hergestellt durch Halluzination mit AlphaFold2 und einer Feedback-Schleife. Die Designs (HAL = Halluzination, violette Datenpunkte) haben eine andere Struktur als die in der Proteindatenbank (PDB). Abbildung aus Quelle 6)</figcaption>
</figure>
</figure>
AlphaFold2 sagt zun&auml;chst voraus, zu welcher Struktur diese Sequenz f&uuml;hren w&uuml;rde. Dabei bewertet das Programm, ob die Vorhersage realit&auml;tsnah ist, also eine faltbare Struktur liefert, und ob die Designkriterien erf&uuml;llt sind &ndash; hier, ob sich ein Oligomer bildet. Die Sequenz wird anschlie&szlig;end ver&auml;ndert und der Vorhersageprozess so oft neu gestartet (Halluzinieren), bis eine realistische Proteinstruktur erreicht ist. Die Strukturen der neuen Designs sind vielf&auml;ltiger als bekannte Oligomere (Abbildung 9). Das Verfahren ist jedoch rechenintensiv. Au&szlig;erdem muss das Tool ProteinMPNN die Aminos&auml;uresequenz optimieren, damit sich nicht nur faltbare, sondern l&ouml;sliche Proteine bilden.
Ein &auml;hnliches Vorgehen lieferte Proteinger&uuml;ste (scaffolds) f&uuml;r Luciferasen. Luciferasen sind biolumineszent und werden in Bioassays und Bildgebung eingesetzt.
Das aktive Zentrum wurde anschlie&szlig;end mit der Rosetta-Software in diese Ger&uuml;ste gedockt. Dazu wird ein Teil der Aminos&auml;uresequenz durch das aktive Zentrum der Luciferase getauscht. Verglichen mit nat&uuml;rlichen Enzymen sind die entworfenen Proteine selektiver, was ihre Substrate angeht. Damit eignen sie sich f&uuml;r Bioassays in lebenden Organismen.9)
<h2 type="main">Die richtige Proteinsequenz finden</h2>
Manchmal sind die Anforderungen an die Proteinzielstruktur klar: Die Oberfl&auml;che des Zielproteins ist bekannt, und es soll ein Bindungsprotein entworfen werden, das genau an diese Oberfl&auml;che bindet. Manche Enzyme sollen stabiler oder besser wasserl&ouml;slich werden, ohne dabei Aktivit&auml;t zu verlieren. In diesen F&auml;llen darf sich die Konformation der Hauptkette des Proteins nicht &auml;ndern. Nun soll Proteindesign eine entsprechende Aminos&auml;uresequenz vorschlagen, die sich in die gew&uuml;nschte Struktur faltet (Abbildung 8, S.61).
Auch hier erzielen Deep-Learning-basierte Methoden inzwischen bessere Ergebnisse als bisherige Methoden. Die Software ProteinMPNN aus dem Jahr 202210) nutzt ein Message Passing Neural Network (MPNN, Abbildung 10).11) Dabei erstellt zun&auml;chst ein Struktur-Encoder die 3-D-Struktur ohne Sequenzinformation. Danach versucht ein Sequenz-Decoder, f&uuml;r jede Position eine sinnvolle Aminos&auml;ure vorzuschlagen. Dieser Schritt verl&auml;uft autoregressiv: Welcher Typ Aminos&auml;ure platziert wird, h&auml;ngt von den bereits platzierten Aminos&auml;uren in der Sequenz ab (Abbildung 10, rote Pfeile), aber auch von der 3-D-Umgebung der noch folgenden Aminos&auml;uren (blaue Pfeile). Nicht nur Aminos&auml;uren, die in der Sequenz aufeinanderfolgen, werden ber&uuml;cksichtigt, sondern auch r&auml;umlich benachbarte Aminos&auml;uren (blaue Pfeile). Eine weitere Software f&uuml;r das Proteindesign ist ESM-IF1.12)
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<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/eDdiSAZARzOSPjlRx3p7">
<figcaption><label>Abb.3: </label>Message Passing Neural Network, das von ProteinMPNN eingesetzt wird. Der Sequenz-Decoder schl&auml;gt geeignete Aminos&auml;uren vor, basierend auf der Sequenz und der r&auml;umlichen Nachbarschaft. Abbildung adaptiert aus Quelle 9)</figcaption>
</figure>
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Neben dem Design neuer Proteine samt dazugeh&ouml;riger Sequenzen lassen sich bekannte Proteine mit wenig Rechenaufwand redesignen, um die Ausbeute oder Stabilit&auml;t zu verbessern. So wurde mit ProteinMPNN die TEV-Protease optimiert, die f&uuml;r biotechnologische Arbeiten wichtig ist.13) Das aktive Zentrum und stark konservierte Aminos&auml;urepositionen wurden dabei nicht ver&auml;ndert. Verglichen mit dem Ursprungsenzym liefern die neuen Designs h&ouml;here Ausbeuten und sind thermostabiler sowie katalytisch effizienter.
<h2 type="main">Diffusionsmodelle</h2>
Um g&auml;nzlich neue Proteinstrukturen zu entwerfen, gibt es seit Kurzem Methoden, die auf Diffusionsmodellen basieren. Diese Modelle stecken zum Beispiel in der Software Dall-e, die aus einer Texteingabe neue Bilder herstellt, beispielsweise im Stile der Gem&auml;lde alter Meister.
F&uuml;r das Proteindesign wurden Diffusionsmodelle wie RFdiffusion trainiert, um korrupte, also verrauschte Proteinstrukturen wiederherzustellen.14) Dazu wird zun&auml;chst eine Proteinstruktur schrittweise verrauscht und der Algorithmus an diesen Schritten trainiert. Anschlie&szlig;end lassen sich neue Strukturen generieren, indem der Korruptionsprozess umgekehrt wird. Anf&auml;nglich zuf&auml;lliges Rauschen wird Schritt f&uuml;r Schritt in eine realistische Struktur &uuml;berf&uuml;hrt (Abbildung 11). Mit diesem Vorgehen lassen sich neue Koordinaten f&uuml;r das Proteinr&uuml;ckgrat, also ganz andere Faltungen, erzeugen. Die passende Sequenz erzeugen andere Werkzeuge wie ProteinMPNN.
<figure xml:id="nadc20244143087-fig-0004">
<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/0DAtJJ3QoqoXJk0jhokQ">
<figcaption><label>Abb.4: </label>Links: Diffusionsmodelle werden zun&auml;chst am Prozess des Verrauschens einer Proteinstruktur trainiert. Anschlie&szlig;end l&auml;sst sich der Prozess umkehren, um eine Struktur aus Rauschen zu erstellen (RFdiffusion). Rechts: Strukturen, die mit Chroma entworfen worden sind. Abbildungen adaptiert aus Quelle 12 (links) beziehungsweise 13 (rechts)</figcaption>
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Geometrische Parameter beeinflussen die neue Struktur. So lassen sich gezielt bestimmte Motive oder Ger&uuml;ste herstellen. Das Modell ist schneller als halluzinierende Methoden und kann auch auf einfachen Grafikkarten durchgef&uuml;hrt werden. Seit Kurzem gibt es au&szlig;erdem ein neues Softwarepaket: Chroma integriert das Sequenzdesign direkt in die Methode und hat viele einstellbare Parameter.15) Die damit erzeugten Designs (Abbildung 11, rechts) wurden jedoch noch nicht experimentell &uuml;berpr&uuml;ft. Die Methoden eignen sich besonders, um definierte Nanomaterialien herzustellen, zum Beispiel f&uuml;r den Wirkstofftransport.
<h2 type="main">Herausforderungen und Ausblick</h2>
Die neuen Methoden versprechen unter anderem, das Proteindesign zu beschleunigen, denn erste Designschritte gelingen ohne Hochleistungsrechner. Schwierig bleibt weiterhin, Designs zu validieren: In silico lassen sich beliebige Proteine entwerfen. Fraglich ist aber, ob sich die Aminos&auml;urensequenzen so falten wie geplant. AlphaFold2 eignet sich hier als In-silico-Validierung: Es sagt die Faltung voraus, die sich dann mit der gew&uuml;nschten Struktur vergleichen l&auml;sst.
Bewerten lassen m&uuml;ssen sich die Designs schlie&szlig;lich an der Erfolgsquote, also dem Anteil der sp&auml;ter im Labor aktiven Enzyme oder erfolgreichen Designs. Diese liegt bei den herk&ouml;mmlichen Methoden wie Rosetta meist unter 5 Prozent f&uuml;r das Design neuer Proteine (De-novo-Design), Arbeiten mit den Deep-Learning-basierten Methoden erh&ouml;hten dies auf 5 bis 15 Prozent.14,16) Der letzte Schritt bleibt die Herstellung und Charakterisierung der Proteine &ndash; ohne Experiment geht es nicht.
Die vorgestellten Methoden setzen Deep Learning ein, nutzen aber nur wenig physikalische und chemische Informationen. Herausfordernd ist, diese Informationen und damit die Energiefunktion aus herk&ouml;mmlichen Methoden wie Rosetta in die neue Software zu integrieren. Gerade f&uuml;r Anwendungen mit wenigen Datens&auml;tzen wie Nukleins&auml;uren und Modifikationen von Proteinen ist dies wichtig.17)
Es ist davon auszugehen, dass durch die Integration des Deep Learnings mehr Forschende Proteindesign nutzen werden, auch in der Industrie. Einige Firmen werben schon jetzt damit, dass sie Methoden wie ProteinMPNN einsetzen, um Proteine und Enzyme zu verbessern.
Die Doktorand Laurin Lang hat Tobias Beck bei diesem Beitrag unterst&uuml;tzt. ChatGPT wurde sporadisch eingesetzt, um die &Uuml;bersetzung von englischen Fachbegriffen zu unterst&uuml;tzen.
<h2 type="main">HINTERGRUND: Was ist Deep Learning?</h2>
Deep Learning ist ein Teil des Machine Learnings. Voraussetzung sind gut kuratierte Daten, die als Trainingsdaten einem Algorithmus zur Verf&uuml;gung gestellt werden. Beim Deep Learning extrahiert der Algorithmus eigenst&auml;ndig interessante Merkmale aus den Daten. Damit baut er ein neuronales Netz, das aus mehreren Schichten besteht (&sbquo;deep&lsquo;).
Generative Modelle lernen im Deep Learning mit Trainingsdaten die Datenverteilung und erstellen daraufhin Vorschl&auml;ge f&uuml;r neue Datenpunkte. Die Algorithmen geben Text aus, aber auch Computerquellcode, Musik, Bilder und Videos.
Die Internetseite <a href="https://playground.tensorflow.org" target="_blank" rel="noopener">playground.tensorflow.org</a> (Google) erlaubt, spielerisch in die Welt der neuronalen Netze einzutauchen.
<h2 type="main">Drei Fragen an den Autor: Tobias Beck</h2>
Was sind derzeit Ihre Hauptforschungsprojekte?
Mit meiner Arbeitsgruppe stelle ich Biohybrid-Materialien her. Dazu verwenden wir Protein-Nanocages als Biotemplate f&uuml;r die Synthese und Einkapselung von Nanopartikeln. Die so hergestellten Komposite assemblieren wir zu dreidimensionalen Materialien, die aufgrund der atomar exakt definierten H&uuml;lle der Protein-Nanocages hochgeordnet sind. Aktuelle Arbeiten besch&auml;ftigen sich mit der Strukturaufkl&auml;rung und den optischen Eigenschaften dieser Materialien. Au&szlig;erdem untersuchen wir die Verwendung von proteinbasierten Adsorbermaterialien f&uuml;r die H&auml;modialyse und den Einsatz von Protein-Nanocages f&uuml;r den Wirkstofftransport.
Welche Methode hat sich in den letzten zw&ouml;lf Monaten aus Ihrer Sicht am meisten weiterentwickelt?
Im Bereich des computerbasierten Proteindesigns ist in den letzten Jahren viel passiert. Durch die Einbindung von Deep-Learning-Methoden gab es hier einen riesigen Entwicklungssprung. In den letzten Monaten sind viele neue Arbeiten publiziert worden &ndash; sowohl methodische Entwicklungen als auch Beispiele f&uuml;r Anwendungen. Ich denke, dass sich das Gebiet weiterhin schnell entwickeln wird, gerade mit Blick auf die Anwendung. Durch den einfachen Zugriff auf die rechnerbasierten Methoden, zum Beispiel &uuml;ber Webserver, k&ouml;nnen viele Forschungsgruppen, aber auch die Industrie, das computerbasierte Proteindesign nun in ihrer Forschung nutzen.
Was brauchen Sie heute im Beruf, was Sie im Studium nicht gelernt haben?
Ein Gro&szlig;teil der Kommunikation erfolgt in der Forschung und auch in Teilen der Industrie in englischer Sprache. In meinem Studium wurden aber fast alle Lehrveranstaltungen auf Deutsch gehalten. Durch Auslandsaufenthalte und englischsprachige Lehrveranstaltungen, zum Beispiel im Masterstudium, k&ouml;nnte die Anwendung der englischen Fachsprache weiter trainiert werden.
Tobias Beck ist W1tt-W2-Professor am Institut f&uuml;r Physikalische Chemie der Universit&auml;t Hamburg. Dort forscht er an biohybriden Nanomaterialien. Er promovierte in G&ouml;ttingen bei George Sheldrick. Nach einem Postdoc-Aufenthalt an der ETH Z&uuml;rich habilitierte er sich an der RWTH Aachen.<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/CsjqjKorSXivenmYK34M">
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