Wissenschaft & Forschung

Reaktionen in Biomolekülen sind nun attosekundengenau nachvollziehbar.
S Mit Freie-Elektronen-Lasern (FEL) lassen sich Strukturen von Biomolekülen hochaufgelöst abbilden, denn sie erzeugen sehr kurze und starke Röntgenblitze. Erreichen zwei davon eine Probe kurz hintereinander, liefert das Informationen über die Strukturveränderung während einer Reaktion – der erste Puls initiiert die Reaktion, der zweite misst die Strukturänderung. Bisher war allerdings ein Problem, dass Intensität und Länge der Röntgenblitze von Mal zu Mal variieren, was zu einem unscharfen Bild führt. Physiker der TU München haben nun gemeinsam mit einer internationalen Forschergruppe dieses Problem gelöst: Sie haben den FEL mit einem zirkular polarisierten Infrarotlaser und einem Ring aus 16 Detektoren kombiniert. Dadurch lassen sich zeitlicher Verlauf und Energie jedes Pulses präzise messen, und die Ergebnisse der einzelnen Pulse werden vergleichbar.Das Forscherteam nutzte Röntgenblitze der Linac Coherent Light Source in Menlo Park (USA). Diese schlagen in einer Probenkammer Elektronen aus Neonatomen. Treffen die Elektronen auf einen Infrarotlichtimpuls, werden sie von dessen elektrischem Feld beschleunigt oder gebremst, je nach Feldstärke des Lichtpulses während der Elektronenerzeugung. Die zirkulare Polarisierung gibt dem Elektron eine Richtung.Mit der Technik sollen einzelne Stellen in Molekülen wie Proteinen untersucht werden. EL

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Reaktionen in Biomolekülen sind nun attosekundengenau nachvollziehbar. S Mit Freie-Elektronen-Lasern (FEL) lassen sich Strukturen von Biomolekülen hochaufgelöst abbilden, denn sie erzeugen sehr kurze und starke Röntgenblitze. Erreichen zwei davon eine Probe kurz hintereinander, liefert das Inform...

Prof.Dr.

Säulen für die HPLC werden kleiner und dünner, denn das spart Eluent, und von vielen Proben, etwa aus der Medizin, gibt es oft nur Nanolitermengen. Gefragt ist nun eine Möglichkeit, die es erlaubt, mit den immer geringeren Säulen- und Analytvolumina weiterhin präzise zu arbeiten. Eine Antwort ist, Großteile des HPLC-Systems auf einem Mikrochip zu integrieren.
In der chemischen Analytik entstehen beim permanenten Betrieb eines HPLC-Geräts hohe Kosten durch Eluenten. Bei Flussraten von etwa 1 bis 5 mL·min–1 in laufenden Prozessen sind große Mengen anzuschaffen und zu entsorgen. Zudem bestehen die Eluenten in der weit verbreiteten Umkehrphasen-HPLC (reversed-phase, RP) oft aus den umweltgefährdenden Stoffen Methanol oder Acetonitril (ACN).Für biochemisch-medizinische Anwendungen sind immer häufiger Probenmengen von Mikrolitern bis hinunter zu Nanolitern zu analysieren.Um den Probendurchsatz zu maximieren, sollen also Probenvolumen und Chemikalienverbrauch möglichst klein und die Analysenzeiten möglichst kurz sein. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden und die Leistungsfähigkeit der HPLC zu steigern, haben sich zwei Trends hin zur Miniaturisierung herausgebildet:Der Partikeldurchmesser wurde zum Beispiel für die UHPLC auf unter 2 lm reduziert oder es wird auf Core-Shell-Partikel zurückgegriffen.Parallel dazu wurden die Dimensionen der gesamten Säule teils bis in den µm-Bereich verringert (Nano-LC). Dadurch sinkt der Verbrauch an Eluenten, ohne dass die chromatographische Effizienz nachlässt. Bei Nano- oder Kapillar-LC liegen die Säulendurchmesser bei 50 lm bis etwa 1 mm.Zudem weisen einige Detektoren im Nanoflussbereich eine höhere Empfindlichkeit auf, etwa die Elektrosprayionisations-Massenspektrometer (ESI-MS).Wenn die Säulendurchmesser so klein sind, wird es allerdings schwierig, eine Probe als scharfe Bande homogen am Beginn der Säule aufzubringen und derart kleine Probenbanden effizient von der Säule zum Detektor zu transportieren (peak volume conservation). Bei Säulendurchmessern von 150 lm und kleiner werden schnell die Volumen der Anschluss- und Transferkapillaren ähnlich groß wie das Säulenvolumen selbst. Dies führt zu ungewollten Diffusions- und Mischungsprozessen, welche die einzelnen Banden verwaschen.<h2>Elemente direkt verbinden: Lab-on-a-Chip</h2>Eine elegante Methode, miniaturisierte Elemente ohne nachteilige Zwischenvolumina direkt miteinander zu verbinden, bietet die Lab-on-a-Chip-Technik. Wie in der Mikroelektronik lässt der Lab-on-a-Chip-Ansatz verschiedene Prozesse eines chemischen Labors auf einem einzelnen Mikrochip ablaufen. Davon profitieren besonders die analytischen Trenntechniken.1)Für ein Lab-on-a-Chip wird ein zweidimensionales Netzwerk aus Mikrokanälen (zirka 10 bis 500 lm Kanalbreite, je nach Anwendung) auf einem planaren Substrat erzeugt. Dieses integriert verschiedene fluidische Elemente auf einem Chip, sodass sich winzige Flüssigkeitsvolumina verlustfrei und schnell manipulieren lassen. Einen Vergleich zwischen herkömmlichen HPLC-Säulen und einem HPLC-Mikrochip zeigt Abbildung 1.<figure><img src="https://media.graphcms.com/qEuP7OnRRrGac8m4MRM0"><figcaption><label>Abb. 1: </label>HPLC-Mikrochip von etwa 4 cm Länge (Vordergrund) und herkömmliche HPLC-Säulen.</figcaption></figure>
In der mikrofluidischen HPLC gibt es mehrere Lösungsansätze, um Proben ohne Verlust von der Säule zum Detektor zu transferieren.2,3) Einer ist, die Injektion direkt auf dem Säulenkopf vorzunehmen.4) Hierzu wird über ein Injektionskreuz direkt auf der Säule eine definierte Analytzone aufgebracht, wodurch Transfervolumina entfallen.<h2>Materialien für HPLC-Chips</h2>Bei Lab-on-a-Chip-Systemen ist Glas als Trägermaterial weit verbreitet, da es gegenüber mechanischen und chemischen Belastungen stabil und optisch über einen großen Spektralbereich transparent ist.5) Um die Chips zu fertigen, eignen sich etablierte Methoden aus der Mikrosystemtechnik, zum Beispiel nasschemisches Ätzen. Ein exemplarisches Design mit einer 35 mm langen HPLC-Säule (90 lm Durchmesser) zeigt Abbildung 2.<figure><img src="https://media.graphcms.com/goKQmJ2RTSCGojbiK3la"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Mikrochip-HPLC: a) Typischer HPLC-Mikrochip mit Größenvergleich, b) mikrofluidisches Layout (oben) sowie Strukturen auf dem Chip, bevor (Mitte) und nachdem Säulenmaterial eingebracht wurde;6) c) hochdruckstabile Anschlusstechnik, d) lichtmikroskopische Aufnahmen des Übergangs zwischen Kapillaren und Chipkanälen.7)</figcaption></figure>
Neben monolithischen oder mikrofabrizierten Säulenstrukturen (zum Beispiel micro pillar arrays)8) sind vor allem partikuläre Säulenstrukturen interessant. Die Phasenmaterialien für diese Strukturen haben den Vorteil, dass sie aus großtechnischer Produktion stammen und kommerziell erhältlich sind, dadurch sind etablierte Methoden einfach auf Chips mit dem Material zu transferieren. Das partikuläre Phasenmaterial wird als Suspension unter Druck und Ultraschallagitation in den Säulenkanal gepresst (Abbildung 2b), den zwei poröse Rückhaltestrukturen begrenzen. Anschließend wird der zum Packen verwendete Kanal mit Photopolymerisation flüssigkeitsdicht verschlossen.Die Mikrochips in Abbildung 2 sind aus zwei zusammengeschmolzenen Glassubstraten identischer Dicke hergestellt. Hierbei entsteht durch Photolithographie und anschließendes Flusssäureätzen in der unteren Glasschicht das Kanalnetzwerk. Die obere Schicht erhält durch Sandstrahlen konische Zugangsstrukturen. Über diese Anschlusskonen lässt sich dann die äußere Peripherie mit Kapillaren hochdruckstabil und dispersionsarm anschließen. Hierzu werden Kapillaren mit Stahlklemmen und elastischen Mikrodichtungen mittig auf die Kanalenden der unteren Chipplatte gepresst. Dies gewährleistet einen nahtlosen Übergang der Flüssigkeiten auf den und vom Chip. Diese Verbindungstechnik hält bis über 300 bar aus.<h2>Direkte Kopplung mit Massenspektrometrie</h2>Neben dem nahtlosen Analyttransfer während der Injektion verhindert die Peakvolumenkonservierung, dass sich nach der Säule beim Übertritt in den Detektor kleinste getrennte Analytbanden wieder vermischen. Mit optischen Detektionsmethoden wie der Fluoreszenzdetektion kann je nach Wellenlänge direkt durch das Glas hindurch detektiert oder auch bildgebend gearbeitet werden.Wenn ein ESI-MS-Emitter direkt monolithisch aus dem Chipmaterial hergestellt wird, kann der Chip selbst als Sprayer zur MS-Kopplung dienen (Abbildung 3, S. 1064). Dies ermöglicht einen direkten Transfer von der Säule ins MS. Die Oberfläche des Glases im Austrittsbereich des Säulenkanals wird hydrophob modifiziert, um so das Volumen des Taylor-Konus so gering wie möglich zu halten.9)<figure><img src="https://media.graphcms.com/eNxl9BB0TBpz0AGGw8nF"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Mehrere Funktionalitäten auf einem Chip integriert; links: Mikrodurchflussreaktoren und Chip-HPLC/MS auf einem Chip zur Untersuchung chemischer Reaktionen auf der Nano- und Mikroliterskala;10) rechts: mehrdimensionale Heart-cut-Chip-HPLC.11)</figcaption></figure>
<h2>Systemintegration weiterer chemischer Prozesse</h2>Durch das Netzwerk mikrofluidischer Kanäle auf kleinstem Raum lassen sich Volumen im Nanoliterbereich manipulieren und transferieren. Ein Beispiel ist die On-Chip-Integration eines nur etwa 500 nL großen Mikrodurchflussreaktors und direkt anschließend einer Chip-HPLC-Säule. Über eine automatische Fluidsteuerung kann der Reaktor beladen und nach definierten Zeitintervallen mehrfach hintereinander mit Chip-HPLC/MS beprobt werden. Damit lässt sich der Verlauf chemischer Reaktionen auf der Nano- und Mikroliterskala verfolgen. Ebenso ist es möglich, eine zweite HPLC-Funktionalität zu integrieren und dadurch zweidimensionale Heart-cut-Chip-HPLC durchzuführen (Abbildung 3 rechts).<h2>Temperaturprogrammierung in der Chip-HPLC</h2>Neben der Systemintegration bietet der Miniaturisierungsprozess die Möglichkeit, Skaleneffekte für die HPLC zu nutzen. Hier ist ein attraktiver Optimierungsparameter die Temperatur. Sie beeinflusst physikalische Eigenschaften wie Viskosität und Diffusivität des Eluenten, was wiederum den Fließwiderstand reduziert und die Austauschgleichgewichte verändert.12,13) Ausschlaggebend ist hierbei die thermische Masse des gesamten Systems, die in konventionellen HPLC-Systemen einem schnellen und homogenen Temperaturwechsel entgegensteht. Auf Mikrometerlängen hingegen äquilibrieren sich Trennbett- und Eluenttemperaturen sofort.Um die Trenntemperatur in der Chip-HPLC zu regeln, ist ein leistungsfähiger Säulenthermostat entwickelt worden, der bis 200 °C bei einer maximalen Heizrate von 5 K·s–1 arbeitet. Um thermische Massen so klein wie möglich zu halten, basiert das Design größtenteils auf Polymeren und umschließt die 35 mm lange Säule vollständig. Diese steht in direktem thermischen Kontakt mit zwei unabhängig regelbaren Heizelementen. Beide Elemente befinden sich dabei auf der gesamten Länge jeweils nur im Abstand von 1,1 mm über und unter dem Trennbett. Mit diesem System ist es möglich, die Säulentemperatur auf ein einzelnes Grad Celsius genau zu regeln.Trennungen bei erhöhten Temperaturen laufen schneller als solche bei Raumtemperatur, ohne an Trenneffizienz zu verlieren. Aufgrund der verringerten Viskosität bei höheren Temperaturen ist es auch möglich, sonst eher unzugängliche, umweltfreundlichere Alternativen zu Methanol oder Acetonitril in der mobilen Phase zu verwenden. Bei erhöhten Temperaturen funktionieren beispielsweise Ethanol-Wasser-Gemische.Im Gegensatz zu konventionellen HPLC-Instrumenten ist es bei der mikrofluidischen Hochtemperatur(HT)-HPLC möglich, während einer Analyse exakte Temperaturgradienten zu realisieren. Dies ist ein ergänzender Optimierungsparameter zu den sonst gängigen Lösungsmittelgradienten. Abbildung 4 zeigt zum Vergleich zwei Chip-HPLC-Trennungen mit jeweils Lösungsmittel- und Temperaturprogrammierung. Mit der aktiven HT-HPLC-Programmierung wurde ein Testgemisch aus sieben polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen in weniger als 20 s basisliniengetrennt. Dies war allein mit einem Lösungsmittelgradienten in dieser Geschwindigkeit nicht möglich.<figure><img src="https://media.graphcms.com/NwWU6ro2QDOn3bwvBhVu"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Hochtemperatur-Chip-HPLC: Vergleich zwischen Lösungsmittel- und Temperaturgradienten (ACN: Acetonitril).15)</figcaption></figure>
Beide Herangehensweisen schließen sich allerdings nicht gegenseitig aus. So können Temperatur- und Lösungsmittelgradienten parallel gefahren werden.Mit der Temperatur des Eluenten steigt auch seine Elutionskraft. So entspricht ein Volumenprozent Acetonitril mehr einer Temperaturerhöhung von etwa 3 °C.14) Detektoren wie ein Isotopenverhältnis-MS oder ein Flammenionisationsdetektor (FID), die eine kohlenstofffreie mobile Phase benötigen, funktionieren dadurch mit rein wässriger HT-HPLC.<h2>Ausblick</h2>Der Lab-on-a-Chip-Ansatz mit Hochtemperatur-HPLC birgt Potenzial für weitere Entwicklungen, insbesondere für superkritische Fluide als mobile Phase. Etwa in Verbindung mit der weit verbreiteten Tröpfchenmikrofluidik bietet die Chip-HPLC beispielsweise durch die Integration von Online-flüssig-flüssig- oder Festphasenextraktionen die Möglichkeit, die Zusammensetzung einzelner Mikroreaktionskompartimente zu analysieren.<h2>Quergelesen</h2>Mit Lab-on-a-Chip-Systemen lassen sich kleine Analytvolumen bis in den Nanoliterbereich hinunter manipulieren und analysieren.Auf einem Chip können verschiedene Funktionalitäten nahtlos miteinander verbunden sein, zum Beispiel Mikrodurchflussreaktoren mit HPLC.Für Chip-HPLC können nicht nur Methoden mit Lösungsmittelgradienten, sondern auch solche mit schnellen Temperaturgradienten entwickelt werden.<h2>Vitae</h2>Josef Heiland ist Postdoc am Institut für Analytische Chemie der Universität Leipzig. Er studierte Chemie an der Universität Regensburg und hat in diesem Jahr über Mikrochip-basierte HPLC bei Detlev Belder an der Universität Leipzig promoviert. Für seine Arbeiten zur Hochtemperatur-Chip-HPLC wurde er in diesem Jahr mit dem Eberhard-Gerstel-Preis des Arbeitskreises Separation Science der GDCh ausgezeichnet.<div><img src="https://media.graphcms.com/UNd9TkgRXimxTUPUJOCf">

</div>Detlev Belder ist W3-Professor für analytische Chemie an der Universität Leipzig. Er studierte Chemie an den Universitäten Clausthal und Marburg und promovierte im Jahr 1994 am Max-Planck-Institut für Kohlenforschung in Mülheim an der Ruhr. Nach einem Postdoc-Aufenthalt bei Smith-Kline-Beecham in England übernahm er im Jahr 1995 die Leitung der Chromatographie-Abteilung am MPI für Kohlenforschung. Vor seinem Ruf nach Leipzig im Jahr 2007 wurde er 2006 als W2-Professor an die Universität Regensburg berufen.<div><img src="https://media.graphcms.com/rruMEBS5RlCrUw5EqWbN">

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<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 J. P. Kutter, J. Chromatogr. A 2012, 1221, 72–82</li><li>
2 F. Haghighi, Z. Talebpour, A. S. Nezhad, Trends Anal. Chem. 2018, 105, 302–337</li><li>
3 X. Yuan, R. D. Oleschuk, Anal. Chem. 2018, 90, 283–301</li><li>
4 S. Thurmann, C. Lotter, J. J. Heiland, B. Chankvetadze, D. Belder, Anal. Chem. 2015, 87, 5568–5576</li><li>
5 R. M. Tiggelaar, F. Benito-López, D. C. Hermes et al., Chem. Eng. J. 2007, 131, 163–170</li><li>
6 D. Geissler, J. J. Heiland, C. Lotter, D. Belder, Microchim. Acta 2017, 184, 315–321</li><li>
7 C. Lotter, J. J. Heiland, V. Stein, M. Klimkait, M. Queisser, D. Belder, Anal. Chem. 2016, 88, 7481–7486</li><li>
8 G. Desmet, S. Eeltink, Anal. Chem. 2013, 85, 543–556</li><li>
9 C. Lotter, J. J. Heiland, S. Thurmann, L. Mauritz, D. Belder, Anal. Chem. 2016, 88, 2856–2863</li><li>
10 J. J. Heiland, R. Warias, C. Lotter et al., Lab Chip 2017, 17, 76–81</li><li>
11 C. Lotter, E. Poehler, J. J. Heiland, L. Mauritz, D. Belder, Lab Chip 2016, 16, 4648–4652</li><li>
12 T. Teutenberg, Anal. Chim. Acta 2009, 643, 1–12</li><li>
13 G. Vanhoenacker, P. Sandra, J. Sep. Sci. 2006, 29, 1822–1835</li><li>
14 T. Kondo, Y. Yang, Anal. Chim. Acta 2003, 494, 157–166</li><li>
15 J. J. Heiland, C. Lotter, V. Stein, L. Mauritz, D. Belder, Anal. Chem., 2017, 89, 3266–3271</li></ul>

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