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Die Gruppen von Hyster in Princeton und Yang an der UC Santa Barbara &alpha;-alkylieren asymmetrisch Aminos&auml;uren mit Photokatalyse in Gegenwart des Enzyms L-Threoninaldolase. Beispielsweise liefern Glycin oder D-Alanin (1) enantioselektiv die (S)-Arylalanine (3) in Ausbeuten bis 94 %.

Die Hyster-Gruppe nutzt dazu N-Benzylpyridiniumsalze (2) als Reagenzien und Rose Bengal als Photokatalysator, von dem sie vermuten, dass er an das aktive Zentrum des Enzyms bindet. Dadurch wird (2) zum Benzylradikal reduziert und addiert stereoselektiv an den Iminkomplex aus Pyridoxalphosphat und (1).1)<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/a1Vc83buRqGODYO4O8U3">
Die Yang-Gruppe nutzt photooxidative Bedingungen und benzylische Boronate oder Trifluorborate. Verzweigte Boronate liefern stereoselektiv ein weiteres Stereozentrum in &beta;-Position der Aminos&auml;ure.2) UJ
<ul class="references" cited="no" xml:id="nadc20244144123-bibl-0016">
<li xml:id="nadc20244144123-bib-0016">1) Nature, doi: <accessionid ref="info:doi/10.1038/s41586&ndash;024&ndash;07284&ndash;5">10.1038/s41586&ndash;024&ndash;07284&ndash;5</accessionid></li>
<li xml:id="nadc20244144123-bib-0017">2) J. Am. Chem. Soc., doi: <accessionid ref="info:doi/10.1021/jacs.4c04661">10.1021/jacs.4c04661</accessionid></li>
</ul>

Meldung

Photobiokatalytisch zu quartären Aminosäuren

Die Gruppen von Hyster in Princeton und Yang an der UC Santa Barbara α-alkylieren asymmetrisch Aminosäuren mit Photokatalyse in Gegenwart des Enzyms L-Threoninaldolase. Beispielsweise liefern Glycin oder D-Alanin (1) enantioselektiv die (S)-Arylalanine (3) in Ausbeuten bis 94 %. Die Hyster-Grupp...

&Uuml;ber das gesamte Jahr verteilt publiziert die Redaktion der Nachrichten aus der Chemie Trendberichte &uuml;ber alle chemischen Disziplinen hinweg.

Trendberichte

Chemische Proteinsynthese: Neue Techniken in der Durchflusschemie und selektive Ligationsmethoden erm&ouml;glichen, komplexe und pr&auml;zise modifizierte Peptide und Proteine f&uuml;r biologische Anwendungen herzustellen. Funktionelle Charakterisierung: Mit Methoden aus Mikrobiologie, chemischer Biologie und Biochemie untersuchen Forschende die molekulare Funktion bakterieller Enzyme des Mikrobioms und decken so deren Relevanz bei der Entwicklung von Darmerkrankungen auf. DNA-Origami: Biomolek&uuml;le auf mikro- und nanoskopischer Ebene zu untersuchen soll helfen, neue Therapeutika zu entwickeln, herzustellen und an ihren Zielort zu bringen. Besonders die Interaktionen von Proteinen miteinander und mit Ligandenmolek&uuml;len sind dabei wichtig.
Trendbericht
<h2 type="main">Chemische Proteinsynthese</h2>
In lebenden Organismen werden Proteine von Ribosomen aus den zwanzig kanonischen Aminos&auml;uren hergestellt. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung und Methylierung machen die Strukturen komplexer und werden oft durch Enzyme reguliert. Um Struktur, Dynamik und Interaktionen von Proteinen zu untersuchen, ist es unerl&auml;sslich, pr&auml;zise modifizierte Proteine herzustellen, die PTMs und andere chemische Modifikationen enthalten.
Proteine lassen sich durch rekombinante Expression &ndash; etwa mit einem erweiterten genetischen Code &ndash;, chemische Proteinsynthese oder Kombinationen beider Methoden ma&szlig;schneidern. Rekombinante Methoden liefern zwar Proteine jeder gew&uuml;nschten Gr&ouml;&szlig;e, aber es sind nicht beliebig viele vollst&auml;ndige und selektive Modifikationen m&ouml;glich, sodass sich nicht jedes Wunschprotein herstellen l&auml;sst. Die chemische Proteinsynthese hingegen erm&ouml;glicht, theoretisch unbegrenzt viele nicht-kanonische Aminos&auml;uren mit hoher Pr&auml;zision einzubauen und eignet sich somit, Proteine mit spezifischen PTM-Mustern herzustellen.
Chemisch entstehen Peptide &uuml;blicherweise im von Bruce Merrifield entwickelten Verfahren (solid-phase peptide synthesis, SPPS) an der Festphase. Einzelne Peptide werden &uuml;ber Ligationsverfahren wie die Native Chemical Ligation verkn&uuml;pft, bis die komplette Peptidsequenz des gew&uuml;nschten Proteins erreicht ist. Aufreinigung und Faltung liefern schlie&szlig;lich ein Protein, das f&uuml;r biophysikalische Assays und biologische Tests infrage kommt. Die Gr&ouml;&szlig;e der so zug&auml;nglichen Proteine ist jedoch begrenzt. Dies liegt teils an relativ kurzen (etwa 50 Aminos&auml;uren langen), per SPPS gewonnenen Peptidfragmenten, teils an den speziellen Reagenzien und Methoden, die f&uuml;r eine zunehmende Zahl von Ligationen erforderlich sind. Die hohe Sequenzabh&auml;ngigkeit der SPPS sowie die oft beobachtete geringe L&ouml;slichkeit bestimmter Peptidfragmente sind weitere Schwierigkeiten.
In den vergangenen Jahren wurden viele neue Ans&auml;tze verfolgt, um diese Probleme zu l&ouml;sen. Zudem dienten (semi-)synthetische Proteine in vielen F&auml;llen dazu, zum Beispiel PTM-abh&auml;ngige Protein-Protein-Interaktionen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Dieser Trendbericht pr&auml;sentiert eine Auswahl von Arbeiten seit dem Jahr 2021.
<figure xml:id="nadc20244143478-fig-0001">
<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/KApKZPC2TZCZK6R5Szrl">
<figcaption><label>Abb.1: </label>Ablauf der chemischen (Semi-)Synthese von Proteinen. In den letzten Jahren gab es bei jedem Schritt Neuerungen, die die Proteinsynthese schneller, effizienter und weniger sequenzabh&auml;ngig gestaltet haben.</figcaption>
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<h2 type="main">Durchflussbasierte Synthesemethoden</h2>
Die Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) verwendet ein Harz mit schneidbarem Linker, an dem &uuml;ber abwechselnde Kopplungs- und Entsch&uuml;tzungsschritte das gew&uuml;nschte Peptid entsteht. SPPS ist ein Syntheseverfahren, dessen Entwicklung in den vergangenen Jahren vorangetrieben wurde: Sie soll beispielsweise nachhaltiger gestaltet werden, also weniger und vor allem weniger toxische Abf&auml;lle produzieren,1) und Peptide liefern, die l&auml;nger sind als bisher. Zudem sollen dabei weniger Nebenprodukte entstehen.
In den meisten F&auml;llen findet SPPS im Batch-Verfahren statt, beispielsweise via Mikrowellensynthese. Allerdings werden durchflussbasierte Verfahren wichtiger, denn sie bieten pr&auml;zise kontrollier- und reproduzierbare Reaktionsbedingungen und weniger Nebenreaktionen. Wie beispielsweise Pentelute und Mitarbeiter:innen zeigten, lassen sich mit automatisierter Durchflusschemie innerhalb weniger Stunden Peptide herstellen, die mehr als 160 Aminos&auml;uren lang sind.2) Mit diesem Verfahren entstanden unter anderem native Proteine (Lysozym, Barnase, Sortase A),2) posttranslational modifizierte MYC-Fragmente3) sowie etliche d-Proteine.4) (MYC ist ein Transkriptionsfaktor, der bei den meisten Krebsarten hochreguliert ist.)
Bei der Durchflusschemie entstehen nicht nur weniger Nebenprodukte, die Reaktion am Harz l&auml;sst sich au&szlig;erdem in Echtzeit verfolgen. Dies ist besonders wertvoll, da die Aminos&auml;uren abh&auml;ngig von der Sequenz schwierig zu koppeln sind &ndash; um das gew&uuml;nschte Peptid zu erhalten, muss dann die Synthesestrategie (meist arbeitsintensiv) optimiert werden. Die allgemein akzeptierte Hypothese: Diese schwierigen Peptide bilden &beta;-Faltbl&auml;tter und aggregieren auf dem Harz, was die Reaktionskinetik und die Diffusion der Reagenzien durch das Harz beeintr&auml;chtigt. Alle folgenden Kopplungen und Entsch&uuml;tzungen werden weniger effizient, was zu Nebenprodukten und geringen Syntheseausbeuten f&uuml;hrt. Mit Durchflusschemie und neuen Analyseverfahren l&auml;sst sich genau diese Aggregation beobachten und analysieren.5)
<h2 type="main">Neue Werkzeuge f&uuml;r die chemische Proteinsynthese</h2>
Neben der Festphasen-Peptidsynthese ist die Ligation ein Schl&uuml;sselschritt der chemischen Proteinsynthese. Eine der meistgenutzten Methoden ist die Native Chemical Ligation (NCL), an der ein N-terminaler Thioester sowie ein C-terminales Cystein beteiligt sind. Eine Variante dieser Methode ist die Diselenid-Selenoester-Ligation (DSL): Sie verl&auml;uft h&auml;ufig schneller und mit besseren Ausbeuten, da das beteiligte Selenocystein reaktiver ist als Cystein. Im Jahr 2021 ver&ouml;ffentlichten Payne und Mitarbeiter:innen eine Weiterentwicklung, die durch eine neue photospaltbare Schutzgruppe erm&ouml;glicht, mehrere Fragmente mit DSL iterativ zu koppeln.6) Wie sich in Zusammenarbeit mit Beckers Gruppe zeigte, eignet sich DSL au&szlig;erdem f&uuml;r die Expressed Protein Ligation, bei der ein synthetisches Peptid mit einem rekombinanten Peptid oder Protein ligiert wird. Vorteile der DSL dabei sind hier kurze Reaktionszeiten und die besonders milde, chemoselektive Photodeselenierung: Sie geschieht im w&auml;ssrigen Puffer unter Einwirkung von Licht.7)
Eine weitere Herausforderung in der chemischen Proteinsynthese: Hydrophobe Peptidfragmente l&ouml;sen sich nur schlecht in w&auml;ssrigen Puffern. Um die L&ouml;slichkeit zu erh&ouml;hen, werden reversible L&ouml;slichkeitstags verwendet, die in den letzten Jahren h&auml;ufig mit Ligationsmethoden kombiniert wurden. Li und Mitarbeiter:innen verbanden beispielsweise sowohl die Ser/Thr-Ligation als auch die Cys/Pen-Ligation mit reduzierbaren L&ouml;slichkeitstags &ndash; sowohl f&uuml;r die chemische Proteinsynthese als auch f&uuml;r die Protein-Semisynthese.8)
Unsere Gruppe hat einen Synthesetag (SynTag) entwickelt, der w&auml;hrend der Synthese die Peptidfaltung am Harz vermindert und somit die Reinheit der synthetisierten Peptide erh&ouml;ht.9) Wie sich zeigte, erzielt eine Kombination aus Pbf-gesch&uuml;tzten Argininen und einem schneidbaren MeDbz-Linker (Dawson-Linker) hierbei den besten Effekt (Pbf: (2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl); MeDbz: 3-Amino-4-(methylamino)benzoes&auml;ure). Positive Nebeneffekte dieses SynTags: Nach Entsch&uuml;tzen und Schneiden vom Harz macht er das Peptid besser wasserl&ouml;slich, und der MeDbz-Linker macht ihn vielf&auml;ltig einsetzbar. So l&auml;sst sich der SynTag zur nativen C-terminalen Carbons&auml;ure hydrolysieren; er eignet sich aber auch als Aktivester in der Ligation. So lie&szlig; sich mit SynTag zum Beispiel erstmals die Transaktivierungsdom&auml;ne von MYC mit einer einzigen Native Chemical Ligation synthetisieren. G&auml;ngige Synthesemethoden waren hier nicht erfolgreich, denn eines der Ligationsfragmente aggregierte nicht nur w&auml;hrend der Synthese, sondern war zus&auml;tzlich schwer in w&auml;ssrigen Puffern l&ouml;slich.
Nach Synthese und Aufreinigung der Proteine ist der letzte wichtige Schritt der Proteinsynthese die Proteinfaltung. Viele Proteine enthalten eine oder mehrere Disulfidbr&uuml;cken, die selektiv unter oxidativen Bedingungen gebildet werden m&uuml;ssen. Gerade bei Proteinen mit mehreren Disulfidbr&uuml;cken kann dieser schrittweise Prozess sehr zeitaufw&auml;ndig sein. Im Jahr 2021 zeigten Brik und Mitarbeiter:innen eine generell anwendbare und schnelle Methode, mit der sich mehrere Disulfidbr&uuml;cken kn&uuml;pfen lassen. Sie kombiniert Entsch&uuml;tzungsstrategien (kleine Molek&uuml;le, ultraviolettes Licht und palladiumvermittelte Reaktionen) und f&uuml;hrt so zu einer chemo- und regioselektiven Cystein-Aktivierung.10) Den Nutzen ihrer Strategie demonstrierte die Gruppe, indem sie Proteine wie den Trypsininhibitor EETI-II und ein Conotoxin &ndash; ein Toxin aus dem Gift von Meeresschnecken &ndash; herstellte.
<h2 type="main">Mit (semi-)synthetischen Proteinen biologische Fragen kl&auml;ren</h2>
(Semi-)Synthetische Proteine dienen h&auml;ufig dazu, die Interaktion und Struktur von Proteinen aufzukl&auml;ren, und es lassen sich immer l&auml;ngere Proteine synthetisieren. Im Jahr 2021 publizierten Payne und Mitarbeiter:innen die Synthese des phosphorylierten Insulin-like Growth Factor Binding Protein 2 (IGFBP-2).11) Das 31,5 kDa gro&szlig;e Protein entstand hierbei in insgesamt sieben Ligationsschritten (DSL und NCL) aus acht Peptidfragmenten. In IGF-I-Bindungsassays untersuchte die Gruppe anschlie&szlig;end in vitro, wie die Phosphorylierung die Protein-Protein-Interaktion beeinflusst.
Neben komplett synthetisch hergestellten Proteinen gab es Anwendungen auf dem Gebiet der Protein-Semisynthese. Becker und Bello beispielsweise zeigten im Jahr 2022 die Semisynthese von vier Granulocyte-Colony-Stimulating-Factor(G-CSF)-Proteinen mit unterschiedlichen Glykosylierungsmustern und demonstrierten deren biologische Aktivit&auml;t in Zellproliferationsassays.12) M&ouml;glich wurde die Synthese durch einen neuen photospaltbaren Polyethylenglykol(PEG)-Linker, der die Glykosylierungsausbeuten erh&ouml;hte, sowie Selen-basierten Ligationsmethoden.
Phosphorylierungen und Ubiquitinierungen sind weitere wichtige posttranslationale Modifikationen, die sowohl Struktur als auch Interaktionen mit anderen Proteinbindungspartnern beeinflussen. Beispielsweise stellten Liu, Kobilka, Zheng und Mitarbeiter:innen semisynthethisch den &beta;2-adrenergen Rezeptor (&beta;2AR) her, ein G-protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR), indem sie NCL und enzymatische Ligation kombinierten.13) Der Rezeptor bindet das Hormon Adrenalin und ist ein bedeutendes therapeutisches Ziel f&uuml;r Atemwegserkrankungen wie Asthma. Semisynthetisch wurden mehrere (poly-)phosphorylierte und ubiquitinierte &beta;2AR-Proteine hergestellt, um Unterschiede im Bindungsverhalten zu Proteinen zu untersuchen, welche die intrazellul&auml;ren Signalwege beeinflussen k&ouml;nnten.
Der immer schnellere und routiniertere Zugang zu modifizierten Proteinen wird es erm&ouml;glichen, den Fokus k&uuml;nftig von der Synthese auf die Beantwortung biologischer Fragen zu verlagern.
<h2 type="main">Drei Fragen an die Autorin: Nina Hartrampf</h2>
Ihre Forschung in 140 Zeichen?
Wir entwickeln Methoden und Techniken, um posttranslational modifizierte Proteine zur Beantwortung biologischer Fragen zu synthetisieren.
In welchem Gebiet erwarten Sie in den n&auml;chsten zw&ouml;lf Monaten die gr&ouml;&szlig;ten Entwicklungen und warum?
Bei der immer besseren computergest&uuml;tzten Vorhersage von Proteinstruktur und -funktion anhand der Sequenz. Dies wird voraussichtlich rationale Proteindesign und medizinische Anwendungen stark beeinflussen.
Was brauchen Sie heute im Beruf, was Sie im Studium nicht gelernt haben?
Als Studentin habe ich untersch&auml;tzt, wie facettenreich der Beruf ist. Er vereint nicht nur Forschung und Lehre, sondern auch Projektmanagement, Finanzplanung sowie das Ausbilden und F&ouml;rdern junger Forscher:innen. Das alles macht den Beruf anspruchsvoll, aber extrem spannend und abwechslungsreich.
Nina Hartrampf forscht seit 2020 als Assistenzprofessorin (Tenure Track) an der Universit&auml;t Z&uuml;rich. Zuvor promovierte sie bei Dirk Trauner zu Naturstoffsynthese und arbeitete bei Brad Pentelute am Massachusetts Institute of Technology an Flow-Peptidchemie.<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/5zJHbX0GS9m96AcA260q">
<ul class="references" cited="no" xml:id="nadc20244143478-bibl-0001">
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0001">1 I. Kekessie, K. Wegner, I. Martinez et al., J. Org. Chem. 2024, 89, 4261</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0002">2 N. Hartrampf, A. Saebi, M. Poskus et al., Science 2020, 368, 980</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0003">3 E. T. Williams, K. Schiefelbein, M. Schuster et al., Chem. Sci. 2024, doi: <accessionid ref="info:doi/10.1039/D4SC00481G">10.1039/D4SC00481G</accessionid></li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0004">4 A. J. Callahan, S. Gandhesiri, T. L. Travaline et al., Nat. Commun. 2024, 15, 1813</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0005">5 B. Tam&aacute;s, P. L. Willi, H. B&uuml;rgisser, N. Hartrampf, React. Chem. Eng. 2024, 9, 825</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0006">6 L. Kambanis, T. S. Chisholm, S. S. Kulkarni, R. J. Payne, Chem. Sci. 2021, 12, 10014</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0007">7 S. S. Kulkarni, E. E. Watson, J. W. C. Maxwell et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202200163</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0008">8 J. Liu, T. Wei, Y. Tan, H. Liu, X. Li, Chem. Sci. 2022, 13, 1367</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0009">9 H. B&uuml;rgisser, E. T. Williams, R. Lescure, A. Premanand, A. Jeandin, N. Hartrampf, ChemRxiv 2023, doi: <accessionid ref="info:doi/10.26434/chemrxiv-2023&ndash;7mz2c">10.26434/chemrxiv-2023&ndash;7mz2c</accessionid></li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0010">10 S. Laps, F. Atamleh, G. Kamnesky, H. Sun, A. Brik, Nat. Commun. 2021, 12, 870</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0011">11 B. Premdjee, A. S. Andersen, M. Larance, K. W. Conde-Frieboes, R. J. Payne, J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 5336</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0012">12 L. Kerul, M. Schrems, A. Schmid et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202206116</li>
<li xml:id="nadc20244143478-bib-0013">13 Y. Li, J. Heng, D. Sun et al., J. Am. Chem. Soc. 2021, 143(42), 17566</li>
</ul>

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Photobiokatalytisch zu quartären Aminosäuren

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