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Die Literatur gesichtet und zusammengefasst haben in dieser Ausgabe:Lena Barra, KonstanzCéline Calvino, FreiburgGeorg Dierkes, KoblenzJohanna Heine, MarburgUllrich Jahn, PragTim Neudecker, BremenHydrogele, die sich bei Stoß selbst verstärken | Wang et al. von der Universität Hokkaido in Japan hab...

Forschende bauen Diazirine in Biomolek&uuml;le ein, um diese zu vernetzen und zu markieren &ndash; so finden sie heraus, was Proteine und Lipide tun und mit welchen anderen Teilchen sie interagieren. Mit KI-Werkzeugen oder Bor-haltigen Aminos&auml;uren lassen sich Enzyme mit neuen Funktionen designen, und erstmals wurde am Rechner ein Enzym mit katalytischer Triade entworfen. Durch Spatial Proteomics, Bildgebung und Massenspektrometrie sowie mikroskopiegesteuerte Photo-Biotinylierung lassen sich Proteine in ihrer direkten Umgebung analysieren.
<h2 type="main">Ort- und zeitaufgel&ouml;ste Photoaffinit&auml;tsmarkierung</h2>
Diazirine sind kleine, dreigliedrige Heterocyclen, die aus einem Kohlenstoffatom und zwei Stickstoffatomen bestehen. Beim Erw&auml;rmen oder Kuppeln in der Mikrowelle sind sie stabil &ndash; bei Belichtung bilden sie jedoch reaktive Carben-Intermediate, was sie zu n&uuml;tzlichen photoreaktiven Reagenzien macht. Bei Bestrahlung &ouml;ffnen Diazirine ihren Ring, formen ein Diazo-Intermediat im angeregten Singulett- oder Triplettzustand und erzeugen dann unter Stickstoffverlust ein reaktives Carben (Abbildung 1).1) Die Reaktivit&auml;t und Stabilit&auml;t der einzelnen Diazirine h&auml;ngen von den Substituenten ab. Alkyl-Diazirine reagieren in vitro pH-abh&auml;ngig bevorzugt mit sauren Aminos&auml;ureresten. Dies liegt an der Bildung eines langlebigen Diazo-Intermediats, das von organischen S&auml;uren abgefangen wird, bevor sich ein alkylisches Singulett-Carben bilden w&uuml;rde. Im Gegensatz zu den Alkyldiazirinen bilden Aryltrifluorodiazirine Einschubprodukte mit allen Aminos&auml;uren und sind kaum pH-abh&auml;ngig. Ihre Markierungschemie wird jedoch leicht durch Wasser gehemmt, was auf einen Reaktionsweg &uuml;ber ein Carben-Intermediat hinweist.2&ndash;4) Dar&uuml;ber hinaus ist die Art des Diazirins auch f&uuml;r indirekte, lichtkontrollierte Aktivierungsans&auml;tze entscheidend (siehe unten).5)
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<figure><img alt="image" src="https://eu-central-1.graphassets.com/Aype6X9u2QGewIgZKbFflz/cmcilmp2wqwjs07ummscit05h">
<figcaption><label>Abb.1: </label>Photochemische Reaktivit&auml;t von Diazirinen: Unter Anregung mit Licht &ouml;ffnet sich der Ring, und es entsteht ein Diazo-Intermediat. Dieses reagiert unter Verlust von N2 zu einem Singulett oder Triplett-Carben &ndash; je nach Substituent. Das Carben schiebt sich in polarisierte HA-Bindungen ein. Adaptiert nach Lit. 2)</figcaption>
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Diazirine sind aufgrund ihrer besonderen Reaktivit&auml;t f&uuml;r die Photoaffinit&auml;tsmarkierung (PAM), als Vernetzungsreagenzien oder f&uuml;r Oberfl&auml;chenmodifikationen interessant. PAM existiert bereits seit den 1960er Jahren (Infokasten S. 46).6&ndash;9) Da Diazirine klein sind, beeintr&auml;chtigt PAM kaum die Molek&uuml;le, an die sie gebunden sind. Zudem fungieren sie als maskierte Carbene, die erst durch UV-Bestrahlung reaktiv werden. Der r&auml;umlich und zeitlich regulierbare Aktivierungsprozess erlaubt es den modifizierten Molek&uuml;len, zu ihrem Zielmolek&uuml;l zu diffundieren und dort kovalente Bindungen mit nahegelegenen Biomolek&uuml;len einzugehen. Dies erm&ouml;glicht die Untersuchung von Protein-Ligand-Interaktionen sowie Reaktivit&auml;tszentren von Enzymen und Rezeptoren.1,6)
<h2 type="main">Mit Diazirinen Proteine beobachten</h2>
Heute sind Diazirine weit verbreitet, etwa als nichtkanonische Aminos&auml;uren (nkASs) wie Photo-Leucin, Photo-Isoleucin und Photo-Methionin.10) Diese diazirinhaltigen Aminos&auml;uren lassen sich gezielt in Proteine einbauen, indem deren genetischer Code erweitert wird &ndash; durch gentechnisch ver&auml;nderte tRNA-/tRNA-Synthetase-Paare. So lassen sich Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) durch Photo-Crosslinking identifizieren.
Die Technik nutzten Sieber, Lang und ihr Team: Sie modifizierten mit der nichtkanonischen Aminos&auml;ure DiazK die proteolytische Kammer der mitochondrialen humanen caseinolytischen Protease P (hClpP). Diese hochkonservierte Serinprotease kommt in bakteriellen und eukaryotischen Zellen vor; sie ist mit Regulationsmechanismen der mitochondrialen Protein-Hom&ouml;ostase assoziiert und wird mit mehreren Krankheiten in Verbindung gebracht, beispielsweise Krebs.11&ndash;13) Daher wollten die Forschenden die Substrate von hClpP unter physiologischen Bedingungen unvoreingenommen identifizieren, um die Funktion des Proteins besser zu verstehen.
Um ein passendes gentechnisch ver&auml;ndertes tRNA/tRNA-Synthetase-Paar f&uuml;r die genetische Codeerweiterung zu finden, pr&uuml;ften die Autoren Varianten der Pyrrolysin-tRNA-Synthetase (PylRS). Sie identifizierten eine Variante mit den Mutationen Y271M, L271A, C313A, genannt DiazKRS, die DiazK effizient einbaut. So f&uuml;hrten die Wissenschaftler die diazirinhaltige Aminos&auml;ure an sechs Stellen an der Innenseite von hClpP ein. Sie reinigten das modifizierte Protein, bauten damit einen aktiven Proteasekomplex und charakterisierten diesen in vitro. Anschlie&szlig;end transfizierten sie den Proteasekomplex in HEK-Zellen. Bestrahlung (365-nm-Licht, 15 Minuten) aktivierte und vernetzte die diazirinmodifizierten Aminos&auml;uren in hClpP und vernetzte sie mit den Proteinen, die sich w&auml;hrend der Bestrahlung in der Protease befanden (Abbildung 2). Mit diesem Trapping-Experiment in Kombination mit einer Proteomanalyse identifizierten die Autor:innen Mitglieder des Tricarbons&auml;urezyklus, des Fetts&auml;ure- und Aminos&auml;ureabbaus sowie mehrere mitoribosomale Untereinheiten &ndash; um nur einige Beispiele zu nennen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, wie wichtig hClpP in der respiratorischen Hom&ouml;ostase ist.
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<figure><img alt="image" src="https://eu-central-1.graphassets.com/Aype6X9u2QGewIgZKbFflz/cmcilnclvqzzs07t99fq0omd2">
<figcaption><label>Abb.2: </label>Diazirin-basierte Aminos&auml;uren. a) Aminos&auml;uren mit lichtreaktiven Diazirin-Gruppen (blau) inklusive DiazK ; b) DiazK (rote Punkte) wird als nichtkanonische Aminos&auml;ure (nkAS) rekombinant in die Innenseite der Protease hClpX eingebaut. Wird mit Licht angeregt, reagieren die Diazirin-Gruppen von DiazK und vernetzen so zu untersuchende Proteine, die sich w&auml;hrend der Reaktion innerhalb der Protease befinden (blau). Adaptiert nach Lit. 10&ndash;12)</figcaption>
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<h2 type="main">Lipiden bei der Arbeit zuschauen</h2>
Um den Lipidtransport und Lipid-Protein-Interaktionen (LPIs) zu untersuchen, nutzen Forschende neben PPIs diazirinbasiertes Photocrosslinking. Sie bringen diazirinhaltige Lipide in Membranen oder Lipoproteinkomplexe ein, um zu identifizieren, welche Proteine mit bestimmten Lipiden oder Lipid-Dom&auml;nen interagieren. Indem die Crosslinker die interagierenden Komponenten vernetzen, helfen sie, die Organisation und Dynamik von Lipidrafts zu kl&auml;ren oder die lipidbindenden Stellen an Membranproteinen oder Lipidtransporterproteinen zu kartieren.14)
Tefesse, Schultz und Kollegen betonen, entscheidend sei die exakte Position des Diazirins innerhalb des Photolipids. Dasselbe Grundmolek&uuml;l kann stark unterschiedliche Markierungsprofile ergeben, abh&auml;ngig von der Position des Diazirins.15)
Drescher und Mitarbeitende verwendeten ein diazirinmodifiziertes Phosphatidylcholin (DiazPC) (Abbildung 3), um Einblicke in das Verhalten des unmodifizierten Lipids zu gewinnen.16)
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<figure><img alt="image" src="https://eu-central-1.graphassets.com/Aype6X9u2QGewIgZKbFflz/cmcilr3c0qyjm07um3vrob2gk">
<figcaption><label>Abb.3: </label>Chemische Strukturen eines Diazirin-modifizierten Lipids (DiazPC), das genutzt wird, um verschiedene Membrankomponenten zu vernetzen. Adaptiert nach Lit. 16)</figcaption>
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Sie bauten das Lipid in eine Modellmembran ein, in der au&szlig;erdem ein integrales Membranpeptid platziert wurde. DiazPC reagierte auf UV-Bestrahlung und bildete ein reaktives Carben, das sich mit den anderen Membrankomponenten vernetzte. Wie Massenspektrometrieanalyse zeigte, entstanden nur Quervernetzungen im Kopfgruppenbereich der Doppellipidschicht. Dies liegt daran, dass die Diazirin-Gruppe vergleichsweise polar ist, und sich deshalb nahe den Kopfgruppen anordnet. Dieses Verhalten tritt wahrscheinlich generell bei der Einf&uuml;hrung von Diazirinen an hydrophoben Positionen auf.
<h2 type="main">Hochaufgel&ouml;ste Photomarkierung</h2>
Kleine Molek&uuml;le mit Diazirin-Gruppe sind als Vernetzungsreagenzien weniger selektiv als diazirinhaltige Lipide und Diazirine, die durch nkASs in Peptide und Proteine eingebaut werden. Dies erschwert es, mit ihnen unerwartete Wechselwirkungen eines Proteins von Interesse (POI) zu entdecken. Forscher setzten sie &uuml;berwiegend f&uuml;r proteomische Analysen und die Bildgebung gr&ouml;&szlig;erer Proteinarchitekturen ein. Dabei vernetzten sie s&auml;mtliche Biomolek&uuml;le im beleuchteten Bereich, der oft gr&ouml;&szlig;er als eine einzelne Zelle war.1,6,17) Analytisch schwierig an diesem Ansatz ist, die Wechselwirkungen eines POIs mit allen direkten Interaktionspartnern herauszufiltern. Vereinfachen lie&szlig;e sich dies mit Methoden, die eine h&ouml;here Aufl&ouml;sung erm&ouml;glichen.
K&uuml;rzlich entwickelte ein Team um MacMillan, Fadeyi und Oslund einen Ansatz, bei dem Diazirine indirekt durch einen Dexter-Energie&uuml;bertragungsprozess angeregt werden.18) Die Forschenden identifizierten den Iridium-Photokatalysator ({Ir[dF(CF3)ppy]2(dtbbpy)}PF6); dieser sensibilisiert durch eine hohe Triplettenergie (E3T = 60,1 kcal &middot; mol&ndash;1) ein Aryldiazirin in w&auml;ssrigem Medium mit &uuml;ber 97 Prozent Ausbeute. Dies erfolgt mit blauem Licht (450 nm) in 15 Minuten bei 25 &deg;C und 100 mM H2O/DMSO. Mechanistischen Untersuchungen zufolge l&auml;uft die Wechselwirkung zwischen Aryldiazirin und Ir-Katalysator &uuml;ber einen kurzreichweitigen Dexter-Energie&uuml;bertragungsmechanismus &ndash; nicht &uuml;ber den F&ouml;rster-Mechanismus mit l&auml;ngerer Reichweite. Dies beg&uuml;nstigt das Design, da nur Diazirin-Vernetzer nah am Katalysator aktiviert werden. Da das aus Diazirin gebildete Carben eine kurze Lebensdauer hat, beschr&auml;nkt sich die Diffusion des Crosslinkers auf wenige Nanosekunden. An die Liganden des Ir-Katalysators wurden Substituenten hinzugef&uuml;gt, sodass sich dieser zur Biokonjugation, Mikroskopie und Proteomik einsetzen l&auml;sst.
Der Iridiumkatalysator wurde schlie&szlig;lich mit sekund&auml;ren Antik&ouml;rpern verbunden, um gezielt Protein-Komponenten der Zelloberfl&auml;che photokatalytisch zu markieren (Abbildung 4) &ndash; diese Strategie nennen die Autor:innen &micro;Map. Den Experimenten des Teams um MacMillan zufolge arbeitet &micro;Map sowohl zeitlich als auch r&auml;umlich pr&auml;zise: Die Diazirine werden nur w&auml;hrend der Beleuchtung aktiviert und markiert, was die Markierungsdauer genau kontrollierbar macht. Au&szlig;erdem erlaubt der kleine Aktivierungsradius des Iridiumphotokatalysators eine r&auml;umliche Aufl&ouml;sung selbst zwischen verschiedenen Oberfl&auml;chenproteinen. Bei der gezielten Markierung von CD45, CD29 und CD47 in lebenden Zellen identifizierte die &micro;Map-Proteomik mehrere unterschiedliche Proteingruppen, darunter auch bisher unbekannte Wechselwirkungen.
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<figure><img alt="image" src="https://eu-central-1.graphassets.com/Aype6X9u2QGewIgZKbFflz/cmcilscioxmx007up8wg6muer">
<figcaption><label>Abb.4: </label>Nur nahe dem markierten Protein wird quervernetzt: Blaues Belichten von Zellen regt einen Iridium-Katalysator elektronisch an. Dieser ist kovalent an Antik&ouml;rper gebunden und kann einzelne Proteine der Zellmembran markieren. Diazirine in derselben Probe reagieren nicht direkt durch das blaue Licht, aber werden indirekt &uuml;ber den Iridium-Katalysator durch Dexter-Energietransfer angeregt. Daher entstehen nur in der Umgebung des Photokatalysators die reaktiven Diazirine, die Verbindungen quervernetzen. Adaptiert nach Lit. 18)</figcaption>
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Dieses Konzept wurde rasch in vielen Anwendungen genutzt.17) Forschende integrierten Photokatalysatoren in virale oder bakterielle Komponenten, um die Wechselwirkungen zwischen Wirtszellen und Krankheitserregern zu untersuchen.19&ndash;21) Sie konjugierten Iridiumkatalysatoren an kleine Molek&uuml;le, die als Arzneimittelkandidaten untersucht werden, und erm&ouml;glichten so eine entfernungsbasierte PAM von PPIs des Zielproteins mit Nachbarproteinen.22) Zudem wandelten sie Aryl(trifluormethyl)diazo-Verbindungen mit einem Osmium-basierten Photokatalysator und rotem Licht in Carbene um23) &ndash; ein Meilenstein f&uuml;r Anwendungen mit Tiefenlichtbestrahlung im Gewebe.
<h2 type="main">Ausblick</h2>
Diazirine lassen sich in Proteinen, Lipiden und anderen Biomolek&uuml;len einsetzen, und indirekte Anregungsmethoden erm&ouml;glichen hohe r&auml;umliche Aufl&ouml;sung. Dadurch wird sich zunehmend detaillierter in die r&auml;umlichen Beziehungen zwischen Biomolek&uuml;len blicken lassen, um die grundlegenden Prozesse des Lebens besser zu verstehen.
<h2 type="main">Drei Fragen an die Autorin: Nadja Simeth</h2>
Welche Methode hat sich in den letzten zw&ouml;lf Monaten aus Ihrer Sicht am meisten weiterentwickelt?
Wir haben KI-Tools mehr in die Lehre und die Graduiertenausbildung eingebracht, Regularien geschaffen und bringen den Studierenden bei, die Tools reflektiert zu nutzen.
Was sind derzeit Ihre Hauptforschungsprojekte?
Wir arbeiten an chromoselektiven Molek&uuml;len und Reaktionen, um die Komplexit&auml;t der Lichtkontrolle zu realisieren, und erforschen lichtkontrollierbare Biomakromolek&uuml;le. Multifunktionelle Markierungsmethoden wenden wir in der optischen Mikroskopie an, und wir untersuchen die Strukturaktivit&auml;tsbeziehungen unserer Chromophore, besonders in w&auml;ssriger L&ouml;sung.
Was brauchen Sie heute, was Sie im Studium nicht gelernt haben?
F&uuml;r unsere Forschung brauche ich mehr Aspekte meiner Ausbildung, als ich w&auml;hrend des Studiums gedacht h&auml;tte &hellip; Das liegt vor allem am interdisziplin&auml;ren Charakter unserer Projekte.
Nadja A. Simeth studierte Chemie und promovierte an der Universit&auml;t Regensburg. Nach einem Postdoc in der Gruppe von Ben L. Feringa in Groningen wurde sie 2021 als Juniorprofessorin an die Universit&auml;t G&ouml;ttingen berufen und im April 2025 verstetigt.<img alt="image" src="https://eu-central-1.graphassets.com/Aype6X9u2QGewIgZKbFflz/cmcilsfr2r24l07t9kvz6xf2s">
<h2 type="main">Historie: Photoaffinit&auml;tsmarkierung</h2>
Im Jahr 1962 f&uuml;hrten Westheimer und sein Team das Konzept der Photoaffinit&auml;tsmarkierung (PAM) in die biomedizinische Forschung ein.6,7) Sie nutzten ein bifunktionelles Reagenz mit einer para-Nitrophenyl-Einheit als Abgangsgruppe und einer Diazoacetat-Gruppe, um Chymotrypsin kovalent zu markieren. Die Photolyse des Diazoacetylchymotrypsins beobachteten sie mit Radiochemie. Daraufhin schlugen sie ihre Methode als allgemeine Herangehensweise vor, um Enzymzentren zu markieren und zu charakterisieren. Ab den 1970er Jahren wurde das Konzept als PAM8) bezeichnet und ist inzwischen eine unverzichtbare Forschungsmethode.9)
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