Blickpunkt

Insbesondere bei der Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe ist es wichtig, die Funktionen und Interaktionen von Proteinen zu verstehen.
Typische Fragen bei der Untersuchung neuer Wirkstoffkandidaten sind etwa: Mit welchen Proteinen wechselwirkt ein neuer Wirkstoff — und wie stark sind diese Wechselwirkungen? In welcher Form liegen die Bindungspartner vor? Wie verändern sich die Proteine durch die Wechselwirkung? Ein Messverfahren sollte in kurzer Zeit möglichst viele dieser Fragen beantworten.


<h2>Aktiv statt passiv</h2>
Etablierte Verfahren der Proteinanalytik wie die Quarzkristall-Mikrowaage (quartz crystal microbalance, QCM) und die Oberflächenplasmonenresonanz (surface plasmon resonance, SPR) beantworten diese Fragen jedoch nur unvollständig. Diese Verfahren messen großflächige Änderungen von Grenzflächeneigenschaften wie dem optischen Brechungsindex (SPR) oder einer Massenablagerung (QCM). Sie liefern keine Informationen über die individuelle Form der Zielmoleküle.
Eine neue chipbasierte Messmethode, Switchsense (Abbildung 1), bestimmt parallel die Bindungskonstanten vieler Proteine mit hoher Empfindlichkeit und liefert detaillierte Informationen zur Größe und damit zur Form der Proteine — ein Novum für oberflächenbasierte Analytikplattformen.
Im Gegensatz zu QCM und SPR basiert Switchsense auf dem Einfangen und der aktiven Bewegung der Moleküle auf der Chipoberfläche.


<h2>Aufbau und Prinzip</h2>
Das Funktionsprinzip von Switchsense zeigt Abbildung 2. Die Grundlage bildet ein Biochip mit Mikroelektroden. Diese haben einen Durchmesser von typischerweise 50 bis 500 µM und sind in geringer Dichte mit kurzen DNA-Strängen belegt. Während die DNA-Stränge mit dem unteren Ende kovalent an die Elektroden binden, tragen sie an ihrem freien oberen Ende Proteinrezeptoren, beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente. Das können auch kleine Moleküle wie Biotin und Digoxigenin sein, Ni-NTA und antikörperbindende Proteine. Die Kombinationen aus DNA und Rezeptor heißen Probes.
Ähnlich wie bei QCM und SPR binden die Probes sehr spezifisch ihre Zielproteine aus der Probenlösung. Der entscheidende Unterschied zu älteren Oberflächenbiosensoren ist, dass die Probes nicht nur statisch auf der Oberfläche immobilisiert sind. Stattdessen werden sie aktiv bewegt: Ein elektrisches Wechselfeld an den Elektroden versetzt die DNA-Stränge mit einem negativ geladenen Phosphatdesoxyribose-Rückgrat in Oszillation.
Dieses Schwingverhalten, das eine fluoreszenzspektroskopische Methode in Echtzeit verfolgt, reagiert sehr empfindlich auf Größenänderungen. Bindet ein Zielprotein an die Probes einer Elektrode, so ändert sich schlagartig deren Oszillationsfrequenz. Eine Sättigung von 0,5 % der Probes einer Elektrode erzielt bereits eine messbare Signaländerung. Das entspricht wegen der Elektrodengeometrie und der geringen Probes-Dichte etwa 10 000 gebundenen Proteinen.1 Zum Vergleich: Die Auflösungsgrenze von SPR liegt bei etwa einer Million gebundener Proteine.
Die deutlich bessere Empfindlichkeit bestimmt daher die Bindungskonstante KD auch bei sehr geringen Proteinkonzentrationen. Da sich das An- und Abbinden zudem in Echtzeit verfolgen lässt, bestimmt die Methode auch die Reaktionsratenkonstanten kon und koff.
Der aktuelle Prototyp erreicht Genauigkeiten von weniger als 0,5 kHz. Er misst Frequenzverschiebungen von 100 kHz für große Proteine wie IgG-Antikörper mit einer Masse von 150 kDa; selbst bei kleinen Proteinen wie Cytochrom C mit 12 kDa und einem Durchmesser von weniger als 4 nm sind es noch 10 kHz Frequenzverschiebung.


<h2>Je größer das Protein desto langsamer die Schwingung</h2>
Switchsense informiert also darüber, ob und wie stark ein Zielprotein an einen Rezeptor bindet. Darüber hinaus macht es auch Aussagen über die äußere Gestalt der Proteine.
Die Änderung der Oszillationsfrequenz ist eine Funktion des mittleren Durchmessers des Proteins — genauer: seiner Solvathülle. Die Frequenzverschiebung lässt daher auf die Größe des Proteins schließen. Größenänderungen von weniger als 1 nm sind identifizierbar. Das erlaubt Rückschlüsse darauf, in welcher Form ein Zielprotein während des Bindungsprozesses vorliegt. Agglomerate, falsche Faltungen der Zielproteine oder unerwünschte Kreuzreaktionen mit anderen Proteinen sind auf diese Weise nachweisbar.
Auch die temperaturabhängige Entfaltung eines Proteins in Echtzeit und das Schneiden eines gebundenen Zielmoleküls durch ein hinzugefügtes Enzym sind beobachtbar. Ein weiterer Vorteil der Technik: Sie bestimmt Proteine in komplexen Lösungen wie Zelllysat oder Serum. Der Biochip benötigt zudem nur wenige µL Probe.
Abbildung 3 zeigt eine typische Frequenzanalyse vor und nach der Bindung eines IgG-Antikörpers. Während bei niedrigen Frequenzen die Moleküle dem Wechselfeld mit maximaler Schaltamplitude folgen (ÄF=1), kommt die Bewegung bei sehr hohen Frequenzen zum Erliegen (ÄF=0). Der Abfall der Schaltamplitude bei mittleren Frequenzen ist charakteristisch für die intrinsische Geschwindigkeit der Molekularbewegung: Beim Binden von IgG an ein Antigen (hier: Biotin) am oberen Ende der DNA erhöht sich der hydrodynamische Widerstand des Komplexes und die Frequenzkurve verschiebt sich nach links.


<h2>Anwendungen</h2>
Die Technik informiert über die Gestalt der Bindungspartner. Das ist bei der Entwicklung therapeutischer Antikörper wichtig.2 Das Antikörper-Engineering versucht, die Wirksamkeit von IgG-Antikörpern durch Modifikationen zu erhöhen. Beispielsweise verbessert eine Fragmentierung von Antikörpern, etwa in die Fragmente Fab, F(ab")2 und scFv, deren Penetration in Tumore. Antikörper wiederum, die nur eine Bindungsstelle enthalten, vermeiden ungewünschte Kreuzreaktionen.
Da sich bei diesen Modifikationen sowohl die Bindungsaffinität als auch die Größe ändern, ist Switchsense hier besonders geeignet. Die Technik bestimmt beide Parameter, Größe und Affinität, parallel für viele Zielmoleküle.
Die Methode bestimmt gleichzeitig die Größe der Moleküle und kann daher auch Agglomerate von Antikörpern detektieren. Auch künstliche Antikörper wie Aptamere oder Affibodies lassen sich messen. Die Nachweisgrenze von Switchsense liegt bei einigen Femtomol, die Methode charakterisiert daher hervorragend stark wechselwirkende Bindungspartner mit Dissoziationskonstanten im subnanomolaren Bereich.
Switchsense lässt sich für folgende Zwecke anwenden:
<list list-type="order">
<list-item>
</list-item></list>Wechselwirkung DNA—DNA/RNA, Bestimmung von einzelnen Basen-Fehlpaarungen

<list-item>
Protein-Protein-Wechselwirkungen in Echtzeit, Bestimmung der Konstanten kon, koff, KD, Protein-DNA-Wechselwirkungen, Enzymkinetiken und Wechselwirkungen zwischen Proteinen und kleinen Molekülen
</list-item>
<list-item>
Kontrolle der korrekten Proteinfaltung
</list-item>
<list-item>
Protein- und Antikörper-Engineering 
</list-item>
<list-item>
Aggregation von Proteinen
</list-item>
<list-item>
Thermische Stabilität von Proteinen
</list-item>



<h2>Von der Idee zum Produkt</h2>
Wir haben Switchsense am Lehrstuhl von Gerhard Abstreiter am Walter-Schottky-Institut der TU München entwickelt, in einer Forschungskooperation mit den Fujitsu Laboratories Japan. Nachdem das Potenzial der Methode ersichtlich wurde, gründete die Arbeitsgruppe ein Spin-off, Dynamic Biosensors, das vor allem durch das Exist Forschungstransfer-Programm des Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie gefördert wird. Im Juli gewann das Unternehmen den zweiten Platz beim Münchener Business-Plan-Wettbewerb. Dynamic Biosensors präsentiert das erste Messgerät auf der Biotechnica in Hannover.
Ralf Strasser ist Chemiker und leitet bei Dynamic Biosensors die Forschung und Entwicklung in der Biochemie. Jens Niemax ist promovierter Physiker mit Industrieerfahrung und kümmert sich um die Prototypenentwicklung. Paul Hampel hat Physik studiert und promoviert derzeit am Walter-Schottky-Institut. Uli Rant ist promovierter Physiker und momentan Fellow des Institute of Advanced Study an der TU München. Bei Dynamic Biosensors ist er zuständig für die Geschäftsentwicklung und für Forschung und Entwicklung. <a href="mailto:strasser@dynamic-biosensors.com">strasser@dynamic-biosensors.com</a>


<h2>— — — QUERGELESEN</h2>
Eine neue Messtechnik versetzt DNA-Moleküle auf einem Chip in Schwingungen. Binden sie Zielmoleküle, schwingen sie langsamer.
Aus der Frequenzänderung lässt sich auf die Größe und Form der Zielmoleküle schließen.
Die Technik ist beispielsweise für die Entwicklung therapeutischer Antikörper interessant. Ein  Spin-off der TU München entwickelt die Methode weiter.



<ul>
<li>
1 

 
U. Rant et al.: 
<source>Nano Lett. 
(2009), 
4, 
1290.
</li>
<li>
2 

 
P. J. Carter: 
<source>Nature Rev. 
(2006), 
6, 
343.
</li>
</ul>

Artikel

Leichte Proteine schwingen besser

Insbesondere bei der Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe ist es wichtig, die Funktionen und Interaktionen von Proteinen zu verstehen. Typische Fragen bei der Untersuchung neuer Wirkstoffkandidaten sind etwa: Mit welchen Proteinen wechselwirkt ein neuer Wirkstoff — und wie stark sind diese Wec...

<h2>Analytik/Labortechnik</h2>
Die Massendurchflussregler der Select-Serie von Bronkhorst messen und regeln Gasflüsse von 0 bis 1 mL·min—1 oder von 0 bis 1670 L·min—1. Die Geräte sind in Versionen für Hochdruck bis 700 bar und Hochdurch fluss bis 11 000 m3·h—1 sowie für die Ex-Zone 2 verfügbar.
Bronkhorst High-Tech
Ruurlo/Niederlande, Tel. +31 573 45880-0, Fax -8, <a href="mailto:sales@bronkhorst.com">sales@bronkhorst.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.bronkhorst.com" target="_blank">www.bronkhorst.com</a></ext-link>
Etwa 80 Immunoassays laufen auf dem cobas e 602-Modul von Roche. Es führt 170 Tests pro Stunde durch, zu Herz- und Infektionskrankheiten, Tumormarkern und Arthritis.
Roche, Basel, Tel. +41 61 688 88 88, Fax +41 61 688 27 75, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.roche.com" target="_blank">www.roche.com</a></ext-link>
Die PCR-Platte twin.tec 96 PCR von Eppendorf lässt sich in vier Segmente aufteilen und besteht aus einem Polycarbonatrahmen. Die 24-Well-Segmente sind dünnwandig und aus flexiblem Polypropylen.
Eppendorf, Hamburg, Tel. 040-53801-0, Fax -556, <a href="mailto:eppendorf@eppendorf.com">eppendorf@eppendorf.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.eppendorf.com" target="_blank">www.eppendorf.com</a></ext-link>
Die Klimaregelkammer XCS von Hiden überwacht Temperatur, Luftfeuchte, Gasfluss und Druck der Atmosphäre in der integrierten Kammer oder einem angeschlossenen System. Das Gerät sammelt Daten von bis zu 32 Sensoreingängen und lässt sich an XRD-, NMR-und IR/Raman-Instrumente anschließen.
Hiden Isochema, Kochel am See, Tel. 08857 6930-1, Fax -2, <a href="mailto:info@isochema.de">info@isochema.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.isochema.de" target="_blank">www.isochema.de</a></ext-link>
Das 971-FP-System für die Flash-Chromatographie von Varian detektiert bis zu sieben Wellenlängen gleichzeitig. Sensoren messen den Druck, den Lösemitteldampfdruck und den Abfallfüllstand. Verwendbar sind Säulen mit Trennmaterial von 4 bis 600 g.
Varian Deutschland GmbH, Darmstadt, Tel. 06151 703-242, Fax. -335, de. <a href="mailto:info@varianinc.com">info@varianinc.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="http://www.varianinc.com" target="_blank">http://www.varianinc.com</a></ext-link>
Beim Pegasus Mixer von Dinnissen rotieren zwei Achsen gegeneinander, so dass die Partikel hochgeschleudert werden. Der Mixer dosiert und verarbeitet auch grobe Partikel. Aufgrund der kurzen Mixzeit verringert sich der Energieverbrauch um bis zu 40  % im Vergleich zu früheren Geräten.
Dinnissen, Sevenum/Niederlande, Tel. +31 77 467-3555, Fax -3785, <a href="mailto:powtech@dinnissen.nl">powtech@dinnissen.nl</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.dinnissen.nl" target="_blank">www.dinnissen.nl</a></ext-link>
Die Berghof speedwave four ist ein Gerät für den Mikrowellenaufschluss mit berührungsloser Sensorik. Die Gefäße lassen sich ohne Werkzeug öffnen und schließen. Berghof gibt Garantie auf die Mikrowellenaufschlussgefäße.
Berghof Products + Instruments GmbH, Eningen, Tel. 07121 894-202, Fax -300, <a href="mailto:laboratorytechnology@berghof.com">laboratorytechnology@berghof.com</a><ext-link ext-link-type="uri"><a href="http://www.berghof.com" target="_blank">http://www.berghof.com</a></ext-link>
Die Pipettenspitzen Viaflo Griptips von Integra Biosciences dichten zwischen Spitze und Pipette fester ab als gewöhnliche Spitzen. Dadurch sitzen an einer Mehrkanalpipette alle Spitzen auf gleicher Höhe, und die Flüssigkeitsabgabe wird genauer. Es gibt die Spitzen in den Volumina 12,5; 125; 300; 1250 und 5000 μL.
Integra Biosciences, Fernwald, Tel. 06404 809-0, Fax -251, <a href="mailto:info@integra-biosciences.de">info@integra-biosciences.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.integra-biosciences.de" target="_blank">www.integra-biosciences.de</a></ext-link>
Das Reinigungskit pHit von Metrohm reinigt pH-Elektroden mit Trikaliumphosphat. Im Gegensatz zum Ätzverfahren greift es die Oberfläche nicht an und verlängert so die Lebensdauer der Elektroden.
Deutsche Metrohm GmbH, Filderstadt, Tel. 0711 77088 -0, Fax -55, <a href="mailto:info@metrohm.de">info@metrohm.de</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="http://www.metrohm.de" target="_blank">http://www.metrohm.de</a></ext-link>
l Das Accura Transmissions-Ramanspektrometer von Horiba ist für einen hohen Probendurchsatz ausgelegt. Es liefert Informationen über die Menge an aktiver pharmazeutischer Komponente, die Kristallinität der Probe sowie die Zusammensetzung und Reinheit von Pulvern.
Horiba GmbH, Unterhaching, Tel. 089 462317-0, Fax -99, <a href="mailto:info-sci.de@horiba.com">info-sci.de@horiba.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.horiba.com/de/scientific" target="_blank">www.horiba.com/de/scientific</a></ext-link>
Die Discovery DSC Serie zur dynamischen Differenzkalorimetrie von TA Instruments zeigt eine lineare Basislinie mit Störschwankungen unter 0,08 µW. Die Temperatur lässt sich zwischen —180 und 725 °C regulieren.
TA Instruments, Eschborn, Tel. 06196 400-600, Fax -6060, <a href="mailto:sanderson@tainstruments.com">sanderson@tainstruments.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="http://www.tainstruments.com" target="_blank">http://www.tainstruments.com</a></ext-link>
Das biokompatible UHPLC-Gerät Acquity UPLC H-Class Bio System von Waters analysiert Makromoleküle. Es unterstützt mehrere Chromatographietechniken, mischt Lösungsmittel automatisiert und besteht aus korrosionsbeständigen Materialien.
Waters, Eschborn, Tel. 06196 400 60-0, Fax -10, <a href="mailto:deutschland@waters.com">deutschland@waters.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.waters.com" target="_blank">www.waters.com</a></ext-link>
Die Flow Cellect Kits von Millipore analysieren mit Durchflusszytometrie den Zellzustand auf mitochondriale Störungen, Apoptose und Zelltod.
Millipore, Schwalbach/Taunus, Tel. 0180 5 045- 645, Fax -644, <a href="mailto:GEcustomerservice@millipore.com">GEcustomerservice@millipore.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.millipore.com" target="_blank">www.millipore.com</a></ext-link>
Das PCR-Gerät foodproof Roboprep+ von Biotecon Diagnostics weist Krankheitserreger wie Salmonellen in Lebensmitteln nach.
Biotecon Diagnostics, Potsdam, Tel. 0331 2300-261, Fax -250, <a href="mailto:thein@bc-diagnostics.com">thein@bc-diagnostics.com</a>, <ext-link ext-link-type="uri"><a href="http://www.bc-diagnostics.com" target="_blank">http://www.bc-diagnostics.com</a></ext-link>


<h2>Termine</h2>
Retsch, CEM und Agilent bieten gemeinsam ein Analytikseminar für die Elementanalyse in Feststoffen. Die Teilnehmer bearbeiten mitgebrachte Proben. Die kostenlosen Seminare finden statt am 03.11. in Potsdam, am 04.11. in Leipzig, am 09.11. in Martinsried, am 11.11. inFrankfurt/M., am 16.11. in Hamburg, am 17.11. in Münster und am 18.11. in Kamp-Lintfort.
 <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.retsch.de" target="_blank">www.retsch.de</a></ext-link>


<h2>— — — Wer weiß, wer stürmt? Und wenn ja, wieviel, wann und wohin?</h2>
Mit 12 000 Teilnehmern rechnet die ACS bei ihren Meetings im Frühjahr und Herbst, knapp jedes achte Mitglied läuft bei einer solchen Veranstaltung auf. Da kommt der Besucher der vergleichbaren europäischen Tagung, das sind die vor vier Jahren installierten Euchems-Kongresse, leicht ins Grübeln; rechnet man in Europa mit einer fast so großen Zahl von Chemikern (und jetzt auch immer -innen) wie in den USA, kommt von diesen nur jeder 66. zum großen Treffen. Aber der erfahrene Past President der ACS, Attila Pavlath, beruhigt: Die ACS, vor mehr als 130 Jahren gegründet, habe ihre halbjährlichen Tagungen schon x Mal veranstaltet und in der weiteren Zukunft würde die Euchems-Tagung noch mehr Teilnehmer anlocken als heute. Das brauche seine Zeit. Nur: Ein ganzes Jahrhundert oder mehr wollen die europäische Chemiker nicht warten.
Überhaupt sind Chemiker — wie es in anderen Professionen aussieht, mögen deren Mitglieder verraten — sehr ungeduldig. Wer kennt nicht die personalisierte Interaktion (analog der nukleophilen Substitution) beim Pausengespräch, beim Mixer, bei der Bier-und-Brezel-Postersession: Kaum hat man sich mit einem Gesprächspartner einigermaßen in ein Thema hineingewühlt, kommt der Chemiker angestürmt, der einem ”schon immer Mal etwas sagen wollte“, begrüßt einen der beiden Gesprächspartner überschwänglich und zerrt ihn in eine neue kommunikative Struktur, wobei er gleichzeitig den anderen gnadenlos freisetzt. Diese der SN2-Reaktion ähnliche Substitution lässt zwei frustrierte Partner zurück, einen außerhalb des Systems, einen im System. Überraschend ist immer wieder die Blitzartigkeit, mit der der Personaphile aus der Tiefe des Raumes angreift und wie rasch er die neue energetisch stabile Verbindung aufbaut. Dieses konsequente Zupacken war in Nürnberg nicht nur auf dem gesellschaftlichen Parkett zu sehen, sondern auch am warmen Büffet. Nur eine konsequente sterische Abschirmung wäre im Stande gewesen, das Büffet in der VIP-Lounge des 1. FC Nürnberg gegen die anstürmenden Chemiker bis zum offiziellen Reaktionsstart zu verteidigen. So blieb dem für die Initialzündung doch noch gekommenen Euchemspräsidenten nur noch, ein bereits teilweise metabolisiertes Büffet offiziell frei zu geben.
Stürmisch waren die Chemiker im Übrigen auch beim abendlichen Konzert in der Nürnberger Sebalduskirche. Nachdem klar war, dass frenetisches Klatschen in der Kirche nicht den sofortigen Kirchenausschluss zur Folge haben würde, gab es nach jedem Stück Beifall für die Interpreten. So gelang es den Chemikern sogar, in einer sehr ungewöhnlichen Insertionsreaktion einen stürmischen, die Organistin überraschenden Beifall zwischen Toccata und Fuge (Johann Sebastian Bach, F-Dur, BWV 540) zu platzieren.
Stürmisch geht es auch zu, wenn Sektflaschen ungestüm geöffnet werden. Allerdings nicht immer: Alte Sektflaschen schäumen eher gequält auf. Woran das liegt, wissen Gerhard Hinz sowie der Onkel Max von der Marler Zeitung. Letzterer schreibt, ältere Sektflaschen ”haben keine Kohlensäure mehr und der Sauerstoff ist oxidiert.“
Hätten Sie's gewusst? Ernst Guggolz
PS: In den vergangenen zwei Monaten war Christiane Junk Praktikantin in der Nachrichten-Redaktion. Aktuell ist der Platz bis Juni 2011 ausgebucht.

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