Dynamische Proteine – das intrazelluläre Proteom kartieren/Trendbericht Biochemie 2025 (3/3)

Forschende bauen Diazirine in Biomoleküle ein, um diese zu vernetzen und zu markieren – so finden sie heraus, was Proteine und Lipide tun und mit welchen anderen Teilchen sie interagieren. Mit KI-Werkzeugen oder Bor-haltigen Aminosäuren lassen sich Enzyme mit neuen Funktionen designen, und erstmals wurde am Rechner ein Enzym mit katalytischer Triade entworfen. Durch Spatial Proteomics, Bildgebung und Massenspektrometrie sowie mikroskopiegesteuerte Photo-Biotinylierung lassen sich Proteine in ihrer direkten Umgebung analysieren.

Dynamische Proteine – das intrazelluläre Proteom kartieren

Omics-Techniken erfassen in Zellen systematisch Mutationen, Genexpression, Proteinkonzentrationen und metabolische Zustände. In den letzten zehn Jahren haben sie das Verständnis der zellulären Organisation und molekularen Prozesse erheblich erweitert. Dies gilt sowohl für die Entwicklung von Zellen als auch für pathologische Prozesse wie das Entstehen von Krebs. Globale Omics-Daten erlauben einen umfassenden Einblick in die Zelle – trotz dieser Fortschritte bleibt es jedoch schwierig, verlässliche Aussagen über den Zellphänotyp zu treffen. Denn diesen prägen Wechselwirkungen zellulärer Biomoleküle, die situationsbedingt variieren. Beispielsweise ändern sich Protein-Protein-Interaktionen nach einem externen Stimulus. Solche Interaktionen und subzelluläre Lokalisationen übersehen klassische Omics-Verfahren.

Die Bedeutung subzellulärer Organisation

Eukaryotische Zellen sind hochgradig organisiert. Zwischen Zellkern, Cytosol, den Mitochondrien, endoplasmatischem Retikulum, Golgi-Apparat oder Lysosomen unterscheiden sich der pH-Wert und die Stoffkonzentration, und in jedem Kompartiment laufen spezifische biochemische Reaktionen ab.

Ein oder zwei Membranen kontrollieren die Durchlässigkeit jedes Kompartiments. Beispielsweise ist die innere Mitochondrienmembran hochselektiv; durch den Zellkern dagegen wandern durch große Poren passiv Moleküle bis etwa 50 kDa, und sogar größere Proteine wandern durch seine Membran, benötigen dafür aber aktive Transportmechanismen.¹⁾

Das Cytosol und andere Kompartimente eukaryotischer Zellen haben eine hohe molekulare Dichte, was die freie Diffusion von Proteinen erschwert.²⁾ Um die Zellprozesse zu verstehen, muss wegen der geringen Diffusion und der hohen Kompartmentalisierung nicht nur die Gesamtproteinexpression erfasst werden, sondern auch die räumliche Verteilung von Proteinen. Die räumliche Verteilung entscheidet, ob bestimmte biochemische Reaktionen stattfinden.

Nucleophosmin 1 (NPM1) ist ein klinisch relevantes Beispiel, das zeigt, wie sich Lokalisierungsdynamiken auf den zellulären Phänotyp auswirken. In gesunden Zellen befindet sich NPM1 überwiegend im Nukleolus und übernimmt dort Funktionen in der Genomstabilität, Ribosomenbiogenese und Stressantwort. Bei akuter myeloischer Leukämie (AML) führt eine Mutation zum Verlust des nukleolären Lokalisierungssignals und zur Ausbildung eines nukleären Exportsignals. Dadurch reichert sich NPM1 im Cytoplasma an und erfüllt dort seine physiologischen Funktionen nicht mehr, was den Fortschritt der Leukämie vorantreibt.³⁾

Mit Mikroskopie die Proteinverteilung untersuchen

Traditionell analysieren Forschende die subzelluläre Proteinverteilung vor allem mit fluoreszenzbasierten Mikroskopieverfahren, die weiterhin zu den meistgenutzten gehören. Dafür sind die Zielproteine spezifisch mit einem Fluorophor zu markieren. Das erfolgt auf verschiedene Weise: durch Fusion mit einem Fluoreszenzprotein wie GFP, durch fluorophor-konjugierte Antikörper oder durch kleine Peptid-Tags wie das Halo-Tag, die mit ligandenbasierten Sonden fluoreszenzmarkiert werden.⁴⁾ Mit Mikroskopen lassen sich präzise einzelne Proteine in Zellen orten und ihre Verteilung in Zellpopulationen analysieren. Indem mehrere Proteine in einer einzelnen Messung nachgewiesen werden, genannt Multiplexing, lassen sich mögliche Interaktionen zwischen diesen Proteinen identifizieren.

Ein Vorteil rein mikroskopischer Methoden liegt in der Analyse intakter Zellen, sodass sämtliche Strukturinformationen erhalten bleiben. Die größte Einschränkung ist jedoch, dass die Methode gezielt ist: Die Forschenden müssen die zu untersuchenden Proteine im Voraus auswählen, und es müssen spezifische Antikörper gegen diese vorhanden sein. Daher ist ausgeschlossen, das gesamte Proteom umfassend und unvoreingenommen zu analysieren. Unerwartete Lokalisationen oder neue Interaktionen bleiben also unentdeckt.

Massenspektrometrie-basiertes Proteom-Profiling

Das Proteom in spezifischen zellulären Kompartimenten lässt sich auch analysieren, ohne die Zielproteine im Vorfeld auszuwählen, und zwar mit Verfahren basierend auf Massenspektrometrie. Bei Spatial Proteomics werden mehrere subzelluläre Kompartimente parallel untersucht. Diese Methode ermöglicht Rückschlüsse auf die subzelluläre Proteinlokalisation; je nach Methodik erfasst sie auch deren Dynamik und potenzielle Interaktionen. Verglichen mit globalen Proteomanalysen sind Proben für Spatial Proteomics aufwendiger vorzubereiten, und die Datenauswertung ist komplexer. Allerdings haben technische Fortschritte der letzten Jahre diese Schwierigkeiten zunehmend bewältigt. Insbesondere KI-gestützte Verfahren zur Datenanalyse und -interpretation haben dazu geführt, dass diese Ansätze breiter angewendet werden.

Welche Methode zur Probenvorbereitung und -analyse zu nutzen ist, hängt von der konkreten Forschungsfrage ab: Relevant istunter anderem, welche Zellkompartimente von Interesse sind, welche räumliche Auflösung nötig ist und welche Techniken vorhanden sind. Globale Omics-Techniken sind einfacher zu skalieren, da sich die Probenvorbereitung automatisieren lässt – Spatial Proteomics verlangt meist, jede Probe einzeln vorzubereiten. Spatial Proteomics war zunächst ein Ansatz der Grundlagenforschung, etwa um zelluläre Organisationsprinzipien zu kartieren oder um proteinbasierte Regulationsmechanismen während der Zelldifferenzierung zu identifizieren. Zunehmend nutzt die Technik auch der Forschung im Übergang zwischen Labor und Anwendung sowie der klinischen Forschung. Sie bietet etwa neue Möglichkeiten, um krankheitsspezifische Veränderungen der subzellulären Proteom-Architektur zu charakterisieren, insbesondere in der Onkologie, Neurologie und als Folge von Infektionen.⁵⁾

Subzelluläre Fraktionierung

Da sich kompartimentspezifische Proteine nicht im Massenspektrometer selbst trennen lassen, sind die Zellkompartimente vor der Analyse zu trennen. Dazu werden sie entweder subzellulär fraktioniert oder mikroskopiebasiert segmentiert.

Bei der subzellulären Fraktionierung lysieren Forschende Zellen mit milden Detergenzien oder mechanisch. Dabei löst sich die Plasmamembran auf, die Organellen bleiben jedoch weitgehend intakt (Abbildung 1). Trennen lassen sich die Organellen anhand unterschiedlicher Löslichkeiten oder per Dichtegradienten-Zentrifugation.⁶⁾

Aus zwei Gründen bleibt die subzelluläre Verteilung der Proteine auch über längere Aufbereitungszeiten stabil: Der Umsatz kleiner Metaboliten erfolgt schneller als der Proteinmetabolismus von der Synthese bis zum Abbau. Zudem können große Proteine in der Zelle nur eingeschränkt diffundieren. Arbeiten Forschende nicht mit humanen Primärzellen, können sie Zellen genetisch so modifizieren, dass bestimmte Organellen auf deren Außenseite kompartimentspezifische Oberflächenantigene exprimieren. Diese Antigene lassen sich dann gezielt über hochaffine Antikörper anreichern.

Nach der Fraktionierung werden die isolierten Organellen lysiert, um die Proteine freizusetzen. Diese werden anschließend massenspektrometrisch analysiert. So kartierte im Jahr 2016 die Gruppe um Georg Borner ohne vorhergehendes Zell-Engineering das subzelluläre Proteom von zehn Organellen in HeLa-Zellen, darunter die Plasmamembran und kleine Kompartimente wie Peroxisomen.⁷⁾

Localisation of Organelle Proteins by Isotope Tagging (Lopit), entwickelt von Kathryn Lilleys Team, verbessert das fraktionierungsbasierte Proteom-Profiling.⁸⁾ Zellfraktionen, die durch Dichtegradienten-Zentrifugation entstehen, werden isobarisch markiert, meist mit Tandem Mass Tags (TMT), und gemeinsam in einem einzigen MS-Lauf analysiert. Die Proteinverteilung über die Fraktionen erzeugt hochdimensionale Profile, die mit statistischen Klassifikationsverfahren einer zellulären Lokalisation zugeordnet werden.

Die subzelluläre Fraktionierung wird seit Jahrzehnten genutzt und ist robust, da sie weder komplexe Technik noch viel Vorwissen erfordert. Einzelne Organellen sauber zu trennen bleibt jedoch schwierig. Über einen Algorithmus, die Clusteranalyse, lässt sich jedoch nach der Messung meist feststellen, wie viel welchen Proteins in einem Kompartiment vorkommt. Indem Referenzproteine bekannter Lokalisationen integriert werden, lässt sich die subzelluläre Verteilung unbekannter Proteine mit wahrscheinlichkeitsbasierten Modellen bestimmen. Indem Verteilungsprofile unterschiedlicher Proteine verglichen werden, lassen sich sogar Proteinkomplexe charakterisieren, da deren Proteine ein ähnliches Verteilungsprofil über die analysierten Fraktionen aufweisen.⁶⁾

Bildbasierte Techniken kombiniert mit Massenspektrometrie

Die Zeitschrift Nature Methods hat Spatial Proteomics zur Methode des Jahres 2024 gekürt. Die Auszeichnung würdigte vor allem Verfahren, die das Proteom in Gewebeabschnitten räumlich aufgelöst analysieren. Wichtig dafür sind Imaging-Massenspektrometrie-Techniken (IMS), die regionsspezifische Messungen mit massenspektrometrischer Analyse verbinden. In den letzten fünf Jahren erzielten Forschende hier große Fortschritte, besonders bei der hochaufgelösten Proteomkartierung einzelner Zellen in präparierten Gewebeschnitten, die an die jeweiligen Analysemethoden angepasst wurden.

Ein etabliertes IMS-Verfahren ist das Maldi-Imaging. Dabei setzt laserinduzierte Ionisierung Moleküle aus einer Matrix frei, und diese werden anschließend analysiert. Dabei werden entweder Geweberegionen untersucht (Profiling Mode), oder das Gewebe wird rasterförmig gescannt (Imaging Mode).⁹⁾ Die Verknüpfung der massenspektrometrischen Daten mit den Laser-Positionskoordinaten zeigt räumlich, wo im Gewebe sich wie viel welchen Proteins befindet.

Eine weitere Methode haben Matthias Mann und sein Team entwickelt: Deep Visual Proteomics (DVP).¹⁰⁾ Zunächst erfassen sie das Gewebe mit dem Mikroskop in subzellulärer Auflösung. Deep-learning-gestützte Bildsegmentierung erkennt und klassifiziert einzelne Zellen anhand morphologischer Merkmale. Anschließend trennen die Forschenden die Zellen mit Laser Capture Microdissection (LCM). Die isolierten Einzelzellen analysieren sie dann mit Massenspektrometrie, um das Proteom zu charakterisieren – da eine Zelle jedes Protein in geringem Maße enthält, sind dazu besonders empfindliche Geräte nötig.

Da jede Zelle eindeutig ihrer Position im Gewebe zugeordnet wird, entdeckt die Methode zelltypspezifische und ortsabhängige Unterschiede im Proteom desselben Zelltyps.

Derzeit beschränkt sich die Auflösung von Maldi-Imaging und DVP auf einzelne Zellen. Mit der Laser-Desorption und der LCM lassen sich subzelluläre Strukturen bisher nicht isolieren. Fortschritte in der optischen Auflösung und KI-gestützte Bildanalyse könnten jedoch ermöglichen, größere und morphologisch abgegrenzte Organellen zu untersuchen, etwa den Zellkern.

Ansätze der Interaktionsproteomik eignen sich für die räumlich aufgelöste Proteomanalyse. Das umgeht die technischen Beschränkungen bei der direkten Isolation subzellulärer Kompartimente und profitiert von den Vorteilen bildgebender Verfahren. Protein-Protein-Interaktionen sind oft dynamisch, das heißt, sie können schwach und kurzlebig sein. Um dennoch ein umfassendes Bild der Proteine zu erhalten, die mit einem Zielprotein interagieren, entwickeln Forschungsgruppen chemische Labeling-Methoden. Diese markieren Interaktionspartner dauerhaft bereits während der transienten Bindung.

Dazu wird das Zielprotein genetisch verändert, zum Beispiel durch Fusion mit einer Biotin-Ligase wie BioID oder TurboID. In Anwesenheit eines Substrats wie Biotin markiert das modifizierte Zielprotein kovalent seine Interaktionspartner. Da Biotin in vielen Zelltypen nur gering konzentriert ist, lässt sich das spezifische Anheften an Zielproteine selektiv detektieren. Nach dem Labeling lassen sich biotinylierte Proteine anreichern und mit Massenspektrometrie analysieren.¹¹⁾ Um dieses Konzept auf Spatial Proteomics anzuwenden, bei dem die lokale Proteinverteilung im Vordergrund steht, werden nicht die Proteine spezifisch markiert, die mit einem Zielprotein interagieren. Markiert werden stattdessen die Proteine, die sich in einem bestimmten Zielkompartiment befinden.

Dazu entwickelten Forschende die mikroskopiegesteuerte Photo-Biotinylierung (Abbildung 2).¹²⁾ Zunächst werden Zellen oder Gewebeschnitte mikroskopisch erfasst, und relevante zelluläre Strukturen werden durch Antikörper oder morphologische Merkmale ermittelt. Eine KI-gestützte Bildanalyse überträgt diese Merkmale automatisiert auf mehrere Zellen. Anschließend wird die gesamte Probe mit einem photoaktivierbaren, biotinbasierten Reagenz inkubiert. Ein präziser Laser aktiviert das Reagenz, sodass beispielsweise nur die Proteine in einem bestimmten subzellulären Kompartiment mit Biotin markiert werden. Beim Pooling werden danach die markierten Zellen gemeinsam verarbeitet – das können Hunderttausende sein. So lassen sich auch Proteine identifizieren, die in diesem Zielkompartiment selten sind, und Proteine aus kleinen oder schwer zugänglichen Kompartimenten analysieren. Beispielsweise sind das Proteine, die an Chromatin gebunden haben. DAPI färbt das Chromatin vor der Mikroskopie, und die Photoprobe wird nur am Ort des DAPI-Signals aktiviert. Wird das chromatingebundene Proteom durch Fraktionierung gereinigt, lässt sich schlecht kontrollieren, wie sauber die Fraktion der dort gebundenen Proteine ist – bei subzellulärer Fraktionierung ist meist die Datenanalyse aufwendiger, bei mikroskopiegestützten Verfahren die Probenvorbereitung.

Da die Biotinylierung räumlich präzise ist, verbessert sich zudem das Signal-Rausch-Verhältnis.

Drei Fragen an die Autorin: Franziska Traube

Was sind derzeit Ihre Hauptforschungsprojekte?

Wir untersuchen, wie Epigenom-Dynamiken mit anderen zellulären Prozessen wie Metabolismus und DNA-Reparatur interagieren. Ziel ist es, neue Zusammenhänge aufzudecken, um die Entwicklungsprozesse von Zellen und krankheitsrelevante Mechanismen wie bei Krebs besser zu verstehen und zu adressieren.

Was brauchen Sie heute, was Sie im Studium nicht gelernt haben?

Management-Fähigkeiten wie Teamführung und Budgetplanung. Universitäten bieten hierzu aber inzwischen zahlreiche Kurse für Nachwuchsgruppenleitende an.

Wie schaffen Sie es, Beruf und Familie unter einen Hut zu kriegen?

Mit einem verlässlichen Partner, einer guten Ganztagsschule und bei Bedarf flexiblen Arbeitszeiten gelingt die Vereinbarkeit gut.

Franziska Traube ist Tenure-Track-Professorin für Zelluläre Biochemie an der Universität Stuttgart. Zuvor leitete sie als Liebig-Stipendiatin eine Nachwuchsgruppe in München. In ihrer Forschung untersucht sie epigenetische Prozesse mit dem Schwerpunkt auf Proteinlokalisations- und Proteininteraktionsdynamiken während der Zellentwicklung und Krankheitsentstehung.

• ¹ D. Mohr, S. Frey, T. Fischer, T. Güttler, D. Görlich, EMBO J. 2009, 28, 2541–53
• ² G. C. Brown, J. Theor. Biol. 1991, 153, 195–203
• ³ B. Falini, L. Brunetti, P. Sportoletti, M. P. Martelli, Blood 2020, 136, 1707–1721
• ⁴ Z. Wang, X. Ding, S. Li, J. Shi, Y. Li, RSC Adv. 2014, 4, 7235–7245
• ⁵ M. Uhlén, L. Fagerberg, B. M. Hallström et al., Science 2015, 347(6220), 1260419
• ⁶ E. Lundberg, G. H. H. Borner, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019, 20, 285–302
• ⁷ D. N. Itzhak, S. Tyanova, J. Cox, G. H. Borner, Elife 2016, 5, e16950
• ⁸ T. P. Dunkley, R. Watson, J. L. Griffin, P. Dupree, K. S. Lilley, Mol. Cell. Proteomics 2004, 3, 1128–34
• ⁹ J. L. Norris, R. M. Caprioli, Chem. Rev. 2013, 113, 2309–2342
• ¹⁰ A. Mund, F. Coscia, A. Kriston et al., Nat. Biotechnol. 2022, 40, 1231–1240
• ¹¹ W. Qin, K. F. Cho, P. E. Cavanagh, A. Y. Ting, Nat. Methods 2021, 18, 133–143
• ¹² Y. M. Lin, W. M. Chong, C. K. Huang et al., bioRxiv 2025, 2025.01.24.626799

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