Tracking und Trending im Reinraum

Keime identifizieren und über die Zeit beobachten, ob es mehr werden oder andere Arten dazu kommen – das ist wichtig beim Herstellen steriler Arzneimittel, um Gegenmaßnahmen zu ergreifen und Risiken abzuschätzen. Denn in Umgebungen, die möglichst keimfrei sein sollen, finden sich mehr mikrobiologische Spezies, als man vermuten würde.

In Reinräumen halten Filter und Luftströmung die Staub- und Keimkonzentration in der Luft gering. Dadurch lässt sich die Produktqualität sichern, etwa in Pharmazie, Medizin- oder Halbleitertechnik. Hersteller müssen testen, ob die entsprechenden Räume die Anforderungen erfüllen (Kasten). Dabei ist es wichtig, nicht nur zu einem bestimmten Zeitpunkt auf Mikroorganismen zu prüfen, sondern über die Zeit zu beobachten, wie sich deren Konzentrationen entwickeln. Einzelne Tests zu nur einem Zeitpunkt erfassen die Biodiversität der mikrobiellen Flora nämlich unvollständig. Beim Umgebungsmonitoring über die Zeit wird das Keimspektrum größer; selbst in kontrollierter Umgebung wie einem Reinraum kommen neue Spezies dazu. Bei solchen Umgebungsmonitorings in pharmazeutischen Unternehmen enthielten 93 626 mikrobielle Proben 1992 verschiedene Spezies.

Die schlimmsten Übeltäter

Über die Zeit verändert sich die Zusammensetzung der Keime. Der Anteil einiger häufig vorkommender Mikroorganismen bleibt meist konstant. Dazu gehören die Bakterien Micrococcus spp., Staphylococcus spp. und Bacillus spp. Micrococcus ist meist harmlos; Staphylococcus- und Bacillus-Arten können allerdings Infektionen oder Lebensmittelvergiftungen verursachen. Das Hautbakterium Staphylococcus aureus kann beispielsweise Abszesse, Wundinfektionen, Lungenentzündung oder Sepsis auslösen.

Im Lauf der Zeit kommen weitere Mikroorganismen dazu, deren Anteile meistens niedriger sind. Es handelt sich dabei um eher selten vorkommende Keime. Damit rechnet aufgrund der Reinigung und Desinfektion vorher niemand. Überleben können bestimmte Bakterien solche Prozeduren etwa, weil sie ihren Stoffwechsel temporär herunterfahren und so in eine Art Tiefschlaf fallen. Solche neu dazukommenden und seltenen Mikroorganismen sind die größten Übeltäter, denn sie führen zu gefährlichen Kontaminationen und Out-of-specification-Abweichungen, bei denen das Produkt nicht den Good-manufacturing-practice(GMP)-Anforderungen entspricht. Mögliche Folgen: Hersteller müssen Produktchargen verwerfen oder die Konsument:innen infizieren sich.

Das Umgebungsmonitoring zeigte auch: Je nach Jahreszeit ist die mikrobielle Flora unterschiedlich zusammengesetzt. Das erfordert, das saisonale Risiko zu beurteilen und Reinigungsmaßnahmen entsprechend anzupassen.

Es genügt also nicht, einen Reinraum einmal zu untersuchen und davon auszugehen, er sei damit sicher. Ständiges Verfolgen der Keimbelastung über die Zeit – tracking und trending – ist essenziell, um Kontaminationen vorzubeugen und abzuschätzen, wie anpassungsfähig die gefundenen mikrobiellen Keime sind, etwa gegen Reinigung und Desinfektion. Zudem hilft es den Mitarbeitenden, die mit der Anlage vertraut sind, zu erkennen, wann Grenzwerte überschritten werden könnten, und früh Gegenmaßnahmen zu ergreifen.

Risiko abschätzen

Welche Keime besonders risikoreich sind, hängt von Produkt und Einsatzgebiet ab: Um welche Art Arzneimittel handelt es sich? Wie empfindlich sind die Patient:innen, die es anwenden? Haben sie eine oder sogar mehrere chronische Krankheiten?

Bewertet man das Risiko anhand der Zahl an Arzneimittelrückrufen, liegen gramnegative Bakterien als Hauptrückrufgrund auf Platz eins, gefolgt von Pilzen.¹⁾

Das Risiko im Einzelfall bewerten Produktionsleitung und Mitarbeitende in der Qualitätskontrolle. Wurde eine mikrobielle Kontamination gefunden, ist zu untersuchen, welche Spezies sie verursacht hat. Erst damit lässt sich beantworten, in welcher Umgebung die Keime wachsen und sich vermehren – also bei welcher Temperatur, ob mit oder ohne Sauerstoff und Kohlenstoffquellen – und mit welchen Endotoxinen zu rechnen ist. Endotoxine sind hitzestabile Lipopolysaccharide (LPS), die in der Außenmembran bestimmter Bakterien vorkommen. Wenn die Bakterien sterben oder sich teilen, setzen sie LPS frei, die Fieber, Entzündungen und andere Immunreaktionen auslösen können. Ist das Bakterium bekannt, lässt sich die Gefahr abschätzen.

Wichtig zu wissen ist zudem, ob die entsprechenden Spezies Sporen bilden können, also resistente Entwicklungsformen. Sporenbildner sind etwa Bacillus anthracis, Erreger des Milzbrands, oder Clostridien, die etwa Tetanus oder Botulismus verursachen.

Kontaminationswege

Um gegen die Keime vorzugehen, sind die Kontaminationswege nachzuverfolgen. Dafür ist wichtig, wo welche Bakterienstämme vorkommen: im inneren Reinraum (etwa der Klasse A, Kasten), in vorgelagerten Reinräumen (etwa Klasse B bis D), in wasserzuführenden Leitungen, an Mitarbeitenden oder Patient:innen. Typisieren lassen sich die Bakterien mit Single oder Multi Locus Sequence Typing (SLST oder MLST). Bei MLST werden sieben konservierte Gene sequenziert, sodass sich auch eng verwandte Stämme unterscheiden lassen. SLST verwendet nur ein spezifisches Gen und ist verglichen mit dem MLST schneller und billiger.

Keime aus der Luft lassen sich beispielsweise mit Sedimentationsplatten sammeln, Keime auf Oberflächen oder Mitarbeitenden mit Abklatschtests, bei denen nährbodenbeschichtete Träger auf die zu untersuchende Stelle gedrückt werden. Gerade in der pharmazeutischen Produktion, wo normalerweise wachstumshemmende Bedingungen herrschen, werden so auch lebens-, aber nicht vermehrungsfähige Organismen isoliert. Solche Organismen heißen viable but not culturable (VBNC); sie lassen sich nicht in der Petrischale kultivieren und im Massenspektrometer identifizieren. Stattdessen ist über Sequenzanalyse ein bestimmtes Zielgen nachzuweisen. Bei Bakterien ist das üblicherweise ein etwa 1500 Basen langes Gen, das 16S-rRNA-Gen, das für einen Teil des Bakterienribosoms kodiert. Bei Hefen und Pilzen ist es die Internal-Transcribed-Spacer(IST)-Region, ein spezifischer, nicht-kodierender DNA-Abschnitt.

Ist die sequenzierte Spezies bereits veröffentlicht, lässt sie sich in Datenbanken finden, etwa Silva, Ezbiocloud, Unite oder NCBI Blast. Falls nicht, ist die gefundene unbekannte Spezies zumindest einer Gattung zuzuordnen. Über die Verwandten innerhalb dieser Gattung lässt sich dann das Gefährdungspotenzial abschätzen.

Druckkaskaden helfen zu vermeiden, dass Keime aus vorgelagerten in innere Reinräume überspringen: In Pharmaproduktionen herrschen üblicherweise 10 bis 15 Pascal Überdruck von einem Raum zum nächsten weiter innen liegenden. Bei hochpotenten oder gefährlichen Wirkstoffen ist das umgekehrt: Unterdruck statt Überdruck. Denn dann sind Mitarbeitende vor Exposition mit dem Produkt zu schützen. Beispielsweise werden Waagen und Tablettenpressen dann in Gehäusen unter Unterdruck betrieben, sodass die Substanz nicht in den Reinraum gelangt. Moderne pharmazeutischen Produktionsanlagen sind darauf ausgelegt, sowohl bei Über- als auch bei Unterdruck zu funktionieren.

Mensch, Wasser, Boden

MLST liefert neben Informationen, welche Keime in einzelnen Unternehmen vorkommen, auch Erkenntnisse, woher die Keime kommen.

Der Mensch gilt weithin als Dreckschleuder, als hygienischer Schwachpunkt in Reinräumen schlechthin. MLST-Ergebnisse zeigen: 40 Prozent der bakteriellen Kontaminationen stammen von Menschen, hauptsächlich Hautkeime wie Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Curtobacterium spp., die zu Abszessen, Wundinfektionen oder Sepsis führen können, sowie Darmbakterien wie Salmonella spp. und Enterococcus spp., die etwa Durchfall oder Typhus und Harnwegsinfektionen oder Endokarditis hervorrufen können. Um Kontaminationen durch Menschen zu verhindern, laufen bestimmte Produktionsprozesse vollständig automatisiert in menschenleeren Reinräumen der Klasse A, etwa das Herstellen steriler Injektions- oder Infusionslösungen.

46 Prozent aller in Reinräumen gefundenen Bakterien sind allerdings solche, die im Wasser oder im Erdreich vorkommen, etwa Pseudomonas spp., Ralstonia spp., Bacillus spp. und Burkholderia spp.

Solche Keime tragen Mitarbeitende teilweise über Schuhe und Kleidung ein. Zudem können Keime aus dem Boden in Lüftungsanlagen gelangen, wenn Staub aufgewirbelt wird. Durch die Lüftung kommen sie dann in den Reinraum. An den Innenwänden von Wasserleitungen können sich Biofilme bilden, aus denen sich Keime lösen und so mit dem Wasser in Reinräume gelangen können.

Bei Kontamination mit Wasser- und Bodenkeimen ist daher zu prüfen, ob Mitarbeitende die Hygieneschleusen ordnungsgemäß nutzen und die Reinraumbekleidung richtig anlegen, ob die Lüftungsfilter und Leitungen sauber sind. Ist die Kontaminationsquelle identifiziert, lässt sich Abhilfe schaffen: Lüftungsfilter tauschen, Rohre reinigen, desinfizieren oder schlimmstenfalls tauschen. Werden die Hygieneschleusen zwischen unterschiedlichen Reinraumbereichen nicht ordnungsgemäß genutzt oder Reinraumbekleidung nicht korrekt angelegt? Abhilfe: Mitarbeitende schulen.

Regulierung: Sterile Arzneimittel herstellen

Der EU-GMP-Annex 1 ist das zentrale Regelwerk für das Herstellen steriler Arzneimittel in der EU und für Arbeiten in kontrollierten Umgebungen wie Reinräumen. Bis August 2023 genügte es, die mikrobiologische Gesamtbelastung zu quantifizieren. Mittlerweile ist nachzuweisen, um welche Spezies es sich bei den Verunreinigungen handelt. Bisher unbekannte sind zu bestimmen – oder zumindest deren bekannte Verwandte.²⁾ Zudem ist zu beobachten, wie die Keimzusammensetzung sich über die Zeit ändert. Als Maße für die Belastung dienen die Zahlen der Partikel pro Kubikmeter Luft, die eine Größe von 0,5 µm und 5 µm überschreiten (Tabelle).Grenzwerte für die Partikelbelastung in verschiedenen Reinraumklassen. Daten aus Lit. 2)

Es gelten je nach Reinraumklasse verschiedene Grenzwerte im Betrieb und in Betriebspausen. Werden diese Grenzwerte überschritten, sind Corrective and Preventive Actions (Capas) durchzuführen, bestehend aus Sofortmaßnahmen, etwa Dokumentation oder Produktionsstopp, Analyse der Ursachen sowie korrigierenden und vorbeugenden Maßnahmen.

Die höchsten Anforderungen gelten für Klasse A, zum Beispiel in der sterilen Produktion. Nach dem Zwiebelschalenprinzip ist der Klasse-A-Reinraum üblicherweise von einem der Klasse B umgeben. In diesem werden etwa Lösungen für die sterile Abfüllung vorbereitet. Es folgen Klasse C, etwa zum Herstellen nichtsteriler Tabletten, und Klasse D, beispielsweise für die Endverpackung. Die Speziesanalytik ist nur für die Klassen A und B Pflicht, Expert:innen empfehlen sie aber auch für C- und D-Reinräume. Denn findet man etwa einen Trend zu höheren Konzentrationen eines bestimmten Keims in den äußeren Zwiebelschalen C und D, ist es möglich, dass dieser Keim in die inneren Schalen A und B überspringt. Das lässt sich dann schon früh durch Gegenmaßnahmen verhindern, etwa Austauschen der Filter, Schulen des Personals oder Wechsel der Desinfektionsmittel.

Der Autor

Der promovierte Chemiker Christian Ehrensberger ist freier Mitarbeiter der Nachrichten aus der Chemie.

• ¹ L. Jimenez, BioTech (Basel) 2026, 15, 8, doi: 10.3390/biotech15010008
• ² Good-Manufacturing-Practice(GMP)-Guidelines der Europäischen Kommission: t1p.de/nh9gv

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