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Polykristalline Oberflächen als Strukturbibliothek

Um heterogene Katalyse zu verstehen, sind Oberflächenstrukturbibliotheken oft besser geeignet als Einkristalle: Kombiniert mit ortsaufgelösten kinetischen Experimenten lassen sich damit die Eigenschaften verschiedener kristallographischer Orientierungen unter identischen Reaktionsbedingungen glei...

Prof.Dr.

<p>Wie lässt sich der Grubbs-Hoveyda-II-Katalysator so modifizieren, dass er – verankert an einem Protein – einem Enzym ähnelt? Ein Überblick.</p>
<p>Metalle in ein Protein einzubauen, führt zu hybriden Systemen, den Metalloproteinen. Sind diese Metalloproteine katalytisch aktiv, heißen sie Metalloenzyme. Fast die Hälfte der in der Natur vorkommenden Enzyme sind Metalloenzyme und katalysieren etliche Reaktionen. Das Syntheserepertoire ist in sechs Enzymklassen eingeteilt (Tabelle)<sup>1)</sup> und nutzt überwiegend solche Metallionen, die in wässrigen Systemen gut verfügbar sind, also besonders in biologischen.</p><table-wrap>

<label>Table 1</label><h2>Übersicht der sechs Enzymklassen.</h2><img src="https://media.graphcms.com/42sSUBq3QVWzkVTSOHfD">

</table-wrap><p>Im Zusammenhang mit künstlichen Enzymen hatten Whitesides und Mitarbeiter die Idee, nichtnatürliche Metalle wie Rhodium, Ruthenium oder Osmium und Metallkomplexe in Proteinen zu verankern. Das soll das Spektrum enzymatischer Reaktionen erweitern und die homochirale Umgebung des Proteins für stereoselektive Reaktionen nutzbar machen.<sup>2,3)</sup> Die künstlichen Metalloproteine oder Metalloenzyme katalysieren nichtnatürliche (bioorthogonale) Reaktionen von Olefinen, etwa die synthetisch bedeutsame Olefinmetathese.<sup>4)</sup></p><p>Metalloproteine, welche die Olefinmetathese katalysieren, werden als Metatheasen bezeichnet. Sie haben aber nicht alle Charakteristika eines Enzyms. Metatheasen lassen sich über kovalente, dative oder supramolekulare Bindungen oder Interaktionen von Metallcarbenen in Proteinen synthetisieren (Abbildung 1, S. 858).</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/wdwotLJ1TCWLIJlXh0i7"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Dative, supramolekulare und kovalente Verankerung eines Katalysators (M) an ein Protein.</figcaption></figure>
<p>Zur Verankerung an Proteinen eignen sich insbesondere Varianten des Grubbs-Hoveyda-II-Katalysators, die wasser- und luftstabil und damit biokompatibel sind. Zudem bietet dieser Katalysatortyp verschiedene Möglichkeiten, seine Wasserlöslichkeit zu erhöhen<sup>6)</sup> und sich an definierten Stellen eines Proteins zu verankern.<sup>4)</sup></p><h2>Verankerung an lösliche Proteine</h2><p>Um Metallkatalysatoren an Proteinen zu verankern, werden oft biotinylierte Katalysatoren und die Proteine Streptavidin (Sav) und Avidin (Avi) genutzt. Der Erfolg resultiert aus der hohen Affinität des Biotins zur Bindungstasche von Sav und Avi, die auf einer der stärksten supramolekularen Wechselwirkungen der Natur beruht (K<sub>d</sub> ≈ 10<sup>–14</sup>).<sup>7)</sup></p><p>Um eine lösliche Metathease herzustellen, modifizierte die Gruppe von Ward mit der Biotin-Streptavidin-Technik einen Grubbs-Hoveyda-Katalysator am Rückgrat eines N-heterocyclischen Carbenliganden (NHC), sodass dort eine Biotin-Einheit verankert wurde. Diesen Katalysator ließen sie in einer Pufferlösung mit dem Protein Streptavidin rühren. Substitutionstitration mit 2-(4‘-Hydroxyphenylazo)-benzoesäure (HABA) bestätigte die Verankerung des Katalysators. Die Ringschlussmetathese von N-Tosyl-diallylamin (1) führte nach 16 Stunden mit einem Umsatz von 95 Prozent zum 2,5-Dihydropyrrolderivat (2).<sup>8)</sup></p><p>In dieser Reaktion setzte der proteingeträgerte Katalysator ebensoviel um wie der proteinfreie Katalysator. Ein Biohybrid-Katalysator mit einem kürzeren Linker war weniger aktiv als der Katalysator in Abbildung 3. Dies führen die Autoren auf die Koordination des Katalysators mit den funktionellen Gruppen an der Oberfläche des Proteins zurück.</p><p>Eine hydrophile, koordinierende Proteinumgebung desaktiviert vermutlich synthetische Metallkatalysatoren. Deshalb wählten Hayashi, Okuda und Schwaneberg das relativ kleine β-Fassprotein Nitrobindin (NB) mit einer hydrophoben Kavität als Hülle. In natürlichem Zustand enthält NB eine Häm-Gruppe, welche die Autoren mit rationalem Protein Engineering entfernten. Zudem ersetzten sie die beiden Histidin-Aminosäuren in der Kavität durch Alanin oder Leucin; die verzweigen und hydrophilen Seitenketten wurden also durch lineare, hydrophobe ersetzt. Durch Maleimid-Thiol-(Klick-)Reaktion wurde der Ru-Katalysator verankert (Abbildung 2).<sup>9)</sup></p><figure><img src="https://media.graphcms.com/OfzT13rSiqpbWtCXN07v"><figcaption><label>Abb. 2: </label>a) Kristallstruktur des nativen Nitrobindin mit Häm-Gruppe in orange (PDB: 3emm). Hydrophobe Kavität unten links (hydrophobe Reste gelb, hydrophile Reste blau). b) Verankerung der Grubbs-Hoveyda-Katalysatoren an Nitrobindin. c) Romp von Substrat (3) und RCM von Substrat (5) katalysiert durch die nitrobindinbasierten Metalloproteine.</figcaption></figure>
<p>Diese Biohybridkatalysatoren wurden in Romp (Substrat (3)) und RCM (Substrat (5)) getestet. Dabei ist der Vorteil der hydrophoben Umgebung um das Metallzentrum, dass sie hydrophobe Verbindungen wie ein Magnet anzieht. Die Aktivität des proteingeträgerten Katalysators in wässriger Lösung ist mit bis zu 1,25 mM deutlich höher als die des proteinfreien, der unter gleichen Bedingungen nicht aktiv ist. Auch mit einer Katalysatorbeladung von 0,008 Molprozent ist das biohybride System aktiver als Katalysatoren in organischen Lösungsmitteln. Dabei moduliert die Länge des Linkers zwischen Metallkatalysator und Protein die Aktivität: Bei Sav und NB wird sie durch längere Linker erhöht.</p><h2>Verankert an Membranproteinen</h2><p>Membranproteine sind in biologischen Membranen eingebaut und regulieren beispielsweise den Stofftransport. Das Transmembranprotein ferric hydroxamate uptake protein component A, FhuA, ist in seiner natürlichen Form ein Eisentransporter in der äußeren Membran von Escherichia coli (E. coli). Okuda und Schwaneberg modifizierten es biotechnisch (Abbildung 3) und stellten damit biohybride Katalysatoren her.<sup>10,11)</sup> Dazu entfernten sie im Inneren des FhuA 160 Aminosäuren, wodurch eine hydrophile Pore entsteht. Diese ist etwa 1,4 bis 1,6 nm groß und bietet daher ausreichend Platz, um Metallkatalysatoren zu verankern.</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/LcZMHGSqQJSnVRM68VqN"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Der FhuA-Wildtyp und das um die Kork-Domäne befreite FhuA, das als Ligandensphäre für Biohybridkatalysatoren verwendet wird. Das Cystein C545 ist in gelb gezeigt, die (TEV)-Schnittstellen mit dem Fragment von 5,9 kDa in orange.</figcaption></figure>
<p>An einem extra in der Pore eingebauten freien Cystein lässt sich der Metallkatalysator kovalent verankern. Dazu wurden computerunterstützt solche Aminosäurereste identifiziert und ausgetauscht, die das Cystein abschirmen und eine Metallkatalysatoranbindung verhindern. Da das Membranprotein mit zirka 63,5 kDa relativ schwer ist, wurden zusätzlich zwei spezifische Proteaseschnittstellen eingebaut. Dadurch ließ sich mit einer Enzymschere (TEV-Protease) das Peptidsegment herausschneiden, an das der Metallkatalysator bindet. Das kleinste dabei entstehende Fragment wiegt 5,9 kDa und wurde mit Maldi-Tof-Massenspektrometrie detektiert (Abbildung 3).</p><p>Das charakterisierte Metalloenzym wurde in der Ringöffnungsmetathesepolymerisation (Romp) von wasserlöslichem 7-Oxanorbornen (3) eingesetzt. Der C1-Linker lieferte turn over numbers (TON) bis zu 555, beim C3-Linker betrug die TON 365. Dass der kürzere Linker mehr Umsatz liefert, liegt vermutlich an der eingeschränkten Bewegungsfreiheit des Katalysators und am kürzeren Abstand zu koordinierenden Aminosäureresten. Verglichen mit dem auf Nitrobindin basierenden Katalysator ist die Aktivität jedoch eine Größenordnung kleiner.</p><h2>Olefinmetathese in Zellen</h2><p>Der Vorteil des FhuA-Systems ist, dass es so groß ist, dass sich ähnlich wie mit natürlichen Enzymen spezifische Substratbindestellen einbauen lassen. Das ermöglicht Ganzzellbiohybridkatalysatoren.</p><p>Die angeführten Beispiele basieren auf löslichen Proteinen oder Membranproteinen in homogener Lösung. Dazu wurden isolierte und gereinigte Proteine verwendet. Dies macht die Entwicklung solcher Katalysatoren aufwendig und teuer, da die Proteine zunächst aus Zellen extrahiert und gereinigt werden müssen. Zelllysate eignen sich nicht für synthetische Metallkatalysatoren, da sich darin koordinierende und oxidierende Moleküle befinden, die an den Metallkomplex binden und somit die katalytische Aktivität senken oder ausschalten.<sup>12)</sup></p><p>Um eine Desaktivierung zu vermeiden, haben Jeschek und Kollegen ein Ganzzellsystem entwickelt, in dem sie das System aus Streptavidin und Grubbs-Hoveyda-Katalysator testeten. Das Protein wurde im Periplasma exprimiert, und der Katalysator diffundierte durch die äußere Membran zum Protein (Abbildung 4).<sup>13)</sup> Dieses System funktioniert ohne Proteinreinigung. Zudem ist der Reaktionsraum des Metalloproteins festgelegt; störende, koordinierende Moleküle aus dem Zellinneren erreichen den Katalysator also nicht so einfach. Dazu kommt: Das Periplasma wirkt reduzierend, wodurch stark koordinierende Thiol-Gruppen als Disulfide vorliegen. Nachteile des Periplasmas sind jedoch das relativ geringe Volumen im Vergleich zum Rest der Zelle (etwa 20 Prozent, abhängig von Zellform und -typ) und die dadurch geringe Proteinmenge. Zudem müssen die umzusetzenden Substrate über die äußere Bakterienmembran transportiert werden.</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/UuXdJcScQ8mKQobtKlno"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Ganzzellsystem von Ward und Pahnke. Der Reaktionsraum für den Biohybridkatalysator befindet sich im Periplasma des E. coli.</figcaption></figure>
<p>Dieses Ganzzellsystem wurde in der RCM-Reaktion des Diallylamin-Derivats (7) zum Dihydropyrrol getestet (Abbildung 4). Die Reaktion mit einer optimierten Proteinvariante hat bezogen auf den Metallgehalt eine kleinere TON als der proteinfreie Katalysator (7 beziehungsweise 38).</p><h2>Fazit und Ausblick</h2><p>Die Proteinumgebung der Ligandensphäre am aktiven Metallzentrum beeinflusst die Effizienz des Katalysators. Eine hydrophobe, nichtkoordinierende Umgebung ist vorteilhaft für die Olefinmetathese. Dass Metalloproteine sogar in ganzen Zellen katalytisch aktiv sein können, eröffnet neue Wege in der bioorganischen Synthesechemie. Beispielsweise könnten künstliche Metalloproteine in den Zellstoffwechsel eingebunden werden, um so Metabolite als Wirkstoffe oder Synthesebausteine in Kaskadenreaktionen innerhalb der Zelle zugänglich zu machen.</p><h2>Quergelesen</h2><p>Metallkatalysatoren lassen sich für die Olefinmetathese an löslichen Proteinen oder Membranproteinen verankern. Dafür müssen die Proteine isoliert und gereinigt werden.</p><p>Eine Alternative ist das Ganzzellsystem, das ohne Proteinreinigung auskommt.</p><p>Wie gut die Olefinmetathese katalysiert wird, hängt jeweils von der Länge des Linkers zwischen Protein und Katalysator ab. Zudem beeinflusst die Proteinumgebung am aktiven Metallzentrum die Aktivität des Katalysators.</p><h2>Memo Olefinmetathese</h2><p>Olefinmetathese bezeichnet die katalysierte Spaltung und Bildung von C-C-Doppelbindungen und wird in drei Klassen eingeteilt: Kreuzmetathese (cross metathesis, CM), ringöffnende Metathesepolymerisation (ring-opening metathesis polymerization, Romp) und Ringschlussmetathese (ring-closing metathesis, RCM) (Abbildung 1). Wie die im Jahr 2005 mit dem Nobelpreis ausgezeichneten Arbeiten von Chauvin, Grubbs und Schrock nachwiesen, sind Metallcarbene die aktive Spezies.<sup>5)</sup></p><p>Die verschiedenen Arten der Olefinmetathese.</p><h2>Vitakasten</h2><p>Daniel F. Sauer, Jahrgang 1988, ist Postdoc am Institut für Biotechnologie der RWTH Aachen in der Gruppe von Ulrich Schwaneberg. Seine Forschungsinteressen sind Herstellung und Reaktivität künstlicher Metalloenzyme sowie Lewis-Säure-Base Katalyse. Er studierte Chemie an der RWTH Aachen und schloss sich im Jahr 2013 der Gruppe von Jun Okuda an der gleichen Universität an. Er promovierte im Jahr 2017 über künstliche Metalloenzyme.</p><div><img src="https://media.graphcms.com/AKa5cWjHSUqhs1cvxruG">

</div><p></p><p>Jun Okuda hat seit 2003 den Lehrstuhl für Metallorganische Chemie an der RWTH Aachen inne. Er promovierte im Jahr 1984 bei Gerhard E. Herberich an der RWTH Aachen, forschte als Postdoc bei Richard R. Schrock am MIT und habilitierte sich an der TU München. Er war Professor an der State University of New York in Albany, der Universität Marburg und der Universität Mainz. Seine Forschungsinteressen umfassen Ligandendesign für reaktive Organometallkomplexe, mechanistische Studien von homogenen Katalysatoren und künstliche Metalloenzyme.</p><div><img src="https://media.graphcms.com/wi5IQSZeI7rh5Q5ZDgLK">

</div><p></p><p>Ulrich Schwaneberg, Jahrgang 1969, ist seit 2009 Professor für Biotechnologie an der RWTH Aachen und Mitglied der wissenschaftlichen Leitung des DWI Leibniz-Instituts für interaktive Materialien. Er studierte an der Universität Stuttgart und promovierte bei Rolf D. Schmid. Anschließend war er Postdoc am California Institute of Technology. Von 2002 bis 2009 war er Professor an der Jacobs-Universität Bremen. Zu seinen Forschungsinteressen gehören Protein Engineering und Gerichtete Evolution für Materialien, Biokatalyse und hybride Katalyse.</p><div><img src="https://media.graphcms.com/YFPiZ82qTcuf5tubkYHX">

</div><p></p>
<ul><h2>Literatur</h2><li>
<sup>1 </sup>G. M. Smith, Biotechnology Set, Wiley-VCH, Weinheim, 2008.</li><li>
<sup>2 </sup>M. E. Wilson, G. M. Whitesides, J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 306.</li><li>
<sup>3 </sup>F. Schwizer, Y. Okamoto, T. Heinisch et al., Chem. Rev. 2017, doi: <ext-link ext-link-type="doi">10.1021/acs.chemrev.7b00014</ext-link>.</li><li>
<sup>4 </sup>D. F. Sauer, S. Gotzen, J. Okuda, Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 9174.</li><li>
<sup>5 </sup>R. H. Grubbs, Handbook of Metathesis, Wiley-VCH, Weinheim, 2003.</li><li>
<sup>6 </sup>B. H. Lipshutz, S. Ghorai, Olefin Metathesis [Hrsg.: K. Grela], John Wiley &amp; Sons, Inc., New Jersey, USA, 2014.</li><li>
<sup>7 </sup>N. M. Green, Advances in Protein Chemistry [Hrsg.: J. T. E. C.B. Anfinsen, M. R. Frederic], Academic Press, London, UK, 1975.</li><li>
<sup>8 </sup>C. Lo, M. R. Ringenberg, D. Gnandt, Y. Wilson, T. R. Ward, Chem. Commun, 2011, 47, 12065.</li><li>
<sup>9 </sup>D. F. Sauer, T. Himiyama, K. Tachikawa et al., ACS Catal. 2015, 5, 7519.</li><li>
<sup>10 </sup>F. Philippart, M. Arlt, S. Gotzen et al., Chem. Eur. J. 2013, 19, 13865.</li><li>
<sup>11 </sup>D. F. Sauer, M. Bocola, C. Broglia et al., Chem. Asian J. 2015, 10, 177.</li><li>
<sup>12 </sup>Y. M. Wilson, M. Dürrenberger, E. S. Nogueira, T. R. Ward, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 8928.</li><li>
<sup>13 </sup>M. Jeschek, R. Reuter, T. Heinisch et al., Nature 2016, 537, 661.</li></ul>


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