Blickpunkt


<p>Gebrauchsfertige Kits gewinnen DNA und RNA aus verschiedenen Proben, zum Beispiel </p>
<p><list list-type="order">
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</list-item></list></p><p>aus Geweben von Biopsien oder Versuchstieren</p>

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<p>aus Körperflüssigkeiten wie Blut und Mundschleimhautabstrichen</p>
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<p>aus eukaryotischen und bakteriellen Zellen.</p>
</list-item>
<p></p>
<p>Isolierte DNA wird anschließend typischerweise sequenziert, genotypisiert oder kloniert.</p>
<p>Bevor sich die isolierte Nukleinsäure weiterverarbeiten lässt, muss sie quantifiziert werden. Denn die Menge an Nukleinsäure, die die Kits aus einer Probe isolieren, variiert sehr stark: Es sind wenige Nano- bis einige Mikrogramm. Diese werden üblicherweise in 10 bis 100 µL Puffer eluiert, die Nukleinsäurekonzentrationen liegt also bei einem bis mehreren Tausend ng·µL—1. Die Effizienz der folgenden enzymatischen Reaktionen hängt unter anderem von der relativen Konzentration der Nukleinsäuren ab. Um die richtige Menge an Enzym einzusetzen, muss die Konzentration der Nukleinsäure also möglichst genau bekannt sein.</p>


<h2>Photometrie als Methode der Wahl</h2>
<p>Spektralphotometrische Messungen quantifizieren Nukleinsäuren anhand ihrer Absorption oder Fluoreszenz nach Zugabe von Farbstoffen. Das gängigste Verfahren misst die Absorption der Probe bei 260 nm.1) Dort absorbieren die aromatischen Ringe der Pyrimidin- und Purinbasen. Anhand des Lambert-Beer'schen Gesetzes lässt sich dann die Konzentration von DNA und RNA in der Lösung berechnen.</p>
<p>Als Goldstandards gelten photometrische Messungen in Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm: Diese Methode ist wegen der konstanten und großen Schichtdicke besonders präzise. Allerdings eignet sich das Verfahren nicht für Mehrfachbestimmungen bei einer großen Zahl von Proben, denn nach jeder Analyse muss die Küvette geleert, gereinigt und mit der neuen Probe befüllt werden — eine zeitaufwendige Arbeit.</p>
<p>Liegt die Nukleinsäurekonzentration über 100 bis 200  ng·µL—1, ist die Probe zu verdünnen, da bei zu hohen optischen Dichten das Lambert-Beer'sche Gesetz nicht mehr gilt. Um diese Probleme zu umgehen, arbeiten viele Laboratorien mit 96- oder 384-Well-Mikroplatten und Mikroplattenlesegeräten.</p>
<p>In der Regel misst ein Spektralphotometer senkrecht zur Küvette, so dass die Schichtdicke konstant ist. Mikroplattenleser messen hingegen vertikal, die Schichtdicke hängt also vom Probenvolumen und dem Volumen des Wells ab (Abbildung 1).</p>
<p>Die variable Schichtdicke in den Wells der Mikroplatten lässt sich korrigieren: Man nutzt dafür den kleinen, aber deutlichen Absorptionspeak von Wasser bei 977 nm und vergleicht die Absorption der Lösung bei einer bekannten Schichtdicke mit der Absorption im Mikroplatten-Well. Das Verhältnis entspricht der Schichtdicke in Zentimetern. Die ermittelte Wellenlängenabsorption geteilt durch die Schichtdicke ergibt die Absorption, korrigiert auf eine Schichtdicke von 1 cm.2)</p>


<h2>Klitzekleine Volumina messen</h2>
<p>Mit Küvetten für Mikrovolumina gelingt es, Proben im Mikroliterbereich mit sehr geringer Schichtdicke zu analysieren. Die Nukleinsäureprobe kann dabei unverdünnt bleiben, da sich bei der Messung die optische Dichte der Probe um denselben Faktor reduziert wie die Schichtdicke. Solche Mikrovolumenküvetten passen auch in herkömmliche Spektralphotometern. Viele Proben zu messen, ist allerdings hier genauso zeitaufwendig wie mit Standardküvetten.</p>
<p>Nanodrop von Thermo Scientific ist ein weitverbreitetes Gerät, um Nukleinsäuren in Mikrovolumina zu quantifizieren. Es erzielt mit seinem Probenauftragungssystem einheitliche, sehr dünne Schichtdicken und misst die Absorption. Innerhalb von wenigen Sekunden gibt das Gerät das Messergebnis aus. Andere Hersteller bieten ähnliche Einkanalgeräte für kleine Volumina an.</p>


<h2>Von groß bis klein</h2>
<p>Biotek hat das Spektralphotometersystem Epoch entwickelt, um gleichzeitig Nukleinsäuren in Proben verschiedener Volumina zu analysieren. Das System umfasst ein Mikroplattenlesegerät auf Monochromatorbasis für den UV-Vis-Bereich und die Multivolumenplatte Take3 (Abbildung 2).</p>
<p>Auf der Multivolumenplatte haben in den Mikrospots bis zu 16 Proben ? 2 µL Platz, die Schichtdicke beträgt 0,5 mm. Die dünne Schichtdicke ermöglicht es, auch hochkonzentrierte Proben zu messen. Geeignete Messgefäße sind außerdem 1-cm-Standardküvetten, 6- bis 384-Well-Mikroplatten und die von Biotek entwickelten Biocell-Küvetten. Diese Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm passen auch in Mikroplattengeräte.</p>


<h2>Reproduzierbar und genau</h2>
<p>Heringssperma-DNA-Proben sowie DNA- und RNA-Proben aus den Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters sollten zeigen, ob das Epoch Spektralphotometersystem zur Nukleinsäurequantifizierung geeignet ist. Die Proben wurden in verschiedenen Verdünnungen in den Mikrospots der Multivolumenplatte, in einer Biocell-Küvette oder in Mikroplatten mit 96 Wells gemessen. Als Vergleich dienten Messungen mit dem Nanodrop 2000c </p>
<p>Die isolierte DNA aus den Hamsterzellen wies eine Konzentration von etwa 440 ng·µL—1 auf. Die RNA-Ausbeute lag bei etwa 1800 ng·µL—1. Die Quantifizierung war bei allen getesteten Volumina konsistent mit Abweichungen von weniger als 2,5 %.</p>
<p>Die Messungen sind reproduzierbar: 16 Proben gleicher Konzentration in den Mikrospots der Take3-Platte lieferten Nukleinsäuregehalte mit einem Variationskoeffizient und einer relativen Standardabweichung von jeweils 1,8 %.</p>
<p>Wiederholungsmessungen von Heringssperma-DNA-Proben verschiedener Konzentration in den 16 Mikrospots zeigten: Zwischen den Messungen unverdünnter Mikrovolumina und den Messungen in 1-cm-Biocell-Küvetten besteht eine Differenz von nur 2 %, und zwar über die vielen verschiedenen DNA-Konzentrationen hinweg.</p>


<h2>Fazit</h2>
<p>Das Epoch-Spektralphotometersystem erlaubt es, Nukleinsäuren in Mikrovolumina, Mikroplatten sowie 1-cm-Standard- und 1-cm-BioCell-Küvetten präzise zu quantifizieren. In den Mikrospots der Multivolumenplatte lassen sich bis zu 16 Proben gleichzeitig messen, die isolierten Nukleinsäureproben müssen zuvor nicht verdünnt werden. Die Vergleiche mit Messungen in Standard-1-cm-Küvetten und mit Nanodrop belegen, dass alle Methoden gleich gut sind.</p>
<p><b>Peter Brescia</b> arbeitet als Application Scientist bei Biotek Instruments. <i><a href="mailto:bresciap@biotek.com">bresciap@biotek.com</a></i> <b>Marina Bruss</b> ist dort Produktspezialistin und <b>Peter Banks</b> Scientific Director. <a href="mailto:bruss@biotek.com">bruss@biotek.com</a>; <a href="mailto:banksp@biotek.com">banksp@biotek.com</a></p>


<h2>— — — QUERGELESEN</h2>
<p>Um die Konzentration von Nukleinsäurelösungen zu bestimmen, ist die Photometrie die Methode der Wahl.</p>
<p>Die Messung in Küvetten mit einem Zentimeter Schichtdicke liefert das präziseste Ergebnis; kleinere Volumina zu analysieren, ist oft praktischer.</p>
<p>Ein neues Spektralphotometer misst unterschiedliche Probenvolumina gleichzeitig, von der 1-cm-Küvette bis zur 2-µL-Probe.</p>



<ul>
<li>
<sup>1 </sup>


J.Sambrook, 
D.Russell, 
<source>Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), <publisher-name>Cold Spring Harbor Laboratory Press</publisher-name>, 
2001.

</li>
<li>
<sup>2 </sup>


P.Held, ”<article-title>Nucleic Acid &amp; Protein in the Microplate Format</article-title>“, <source>Chimia 2001, 55, 1–<lpage>2</lpage>, 40—42.
</li>
</ul>


Artikel

Nukleinsäuren in verschiedenen Probenvolumina analysieren

Gebrauchsfertige Kits gewinnen DNA und RNA aus verschiedenen Proben, zum Beispiel aus Geweben von Biopsien oder Versuchstieren aus Körperflüssigkeiten wie Blut und Mundschleimhautabstrichen aus eukaryotischen und bakteriellen Zellen. Isolierte DNA wird anschließend typischerweise sequenz...


<p>Das Qualitätskontrolllabor eines Petrochemie-Unternehmens analysiert pro Jahr bis zu 115 000 Proben von gebrauchten Schiffsdieselmotorölen. Von 55 000 Proben bestimmen die Mitarbeiter die Säuren- oder Basenzahl durch Titration. Die vielen Proben bewältigt nur ein automatisiertes Titrationssystem.</p>
<p>Die Säurezahl der Ölprobe ergibt sich aus der Einwaage und dem Titriermittelverbrauch bis zum Endpunkt der Titration. Das pipettierte Probenvolumen ist also mit der Dichte der Ölprobe zu multiplizieren. Besonders zähflüssige Öle sind abzuwägen. Die Säurezahlen der meisten Ölproben variieren von 0,05 bis 1 mg KOH pro Gramm, aber auch Werte zwischen 5 und 8 mg kommen vor. Die Viskositäten der Ölproben bewegen sich von wässrig-leicht fließend (15 Cst bei 40 °C) bis zu bitumenartig-zähfließend (1000 Cst). Das Pipettiersystem muss seine Ansaug- und Ausstoßgeschwindigkeiten entsprechend anpassen.</p>
<p>Am Anfang der Analyse stand die Frage, wie sich die Ölproben am effizientesten abmessen lassen. Die geforderte Genauigkeit liefert eine analytische Waage, jedoch ist diese Methode fehleranfällig und wenig praktikabel: Das Wägen der Probe ist ein zusätzlicher, manuell ausgeführter Prozessschritt, der sich bei den vielen Proben zu einem stattlichen Zeitaufwand summiert. Die Probe ist außerdem eindeutig zu identifizieren, und das Gewicht der Probe ist dem Titrator zu übermitteln — dabei kann es zu Verwechslungen kommen, vor allem unter Zeitdruck.</p>
<p>Was sind die Alternativen? Öl ist per se flüssig, Pipettieren liegt also nahe. Allerdings sollte der Laborant nur eine ungefähre Menge der Probe in einem Gefäß bereitstellen, das Pipettiersystem entnimmt dann aus dieser Vorlage automatisch die richtige Menge. Idealerweise titriert das System 60 bis 80 Proben pro Tag zuverlässig und unbeaufsichtigt, mit einer Analysenzeit von maximal sechs Minuten pro Probe.</p>


<h2>Pipettieren und Titrieren</h2>
<p>Die Lösung ist ein automatisches Titriersystem aus folgenden Komponenten (Abbildung 1): </p>
<p><list list-type="order">
<list-item>
</list-item></list></p><p>Pipettierautomat</p>

<list-item>
<p>Probengeber</p>
</list-item>
<list-item>
<p>Titrator</p>
</list-item>
<list-item>
<p>Datenverarbeitungssoftware</p>
</list-item>
<p></p>
<p> Der Laborant füllt zur Messung eine geringe Menge der Ölprobe bis zu einer Füllhöhe von etwa 15 mm in einen Becher und platziert ihn auf dem Probenrack. Die Pipette taucht in die Probe, und der Pipettierautomat saugt die Probe luftblasenfrei in die Pipette. Er entnimmt ein definiertes Aliquot und löst es in einem Lösungsmittelgemisch im Titrierbecher.</p>
<p> Auf dem Probengeber steht ein Rack mit 80 Titrierbechern: 76 Becher sind für Ölproben. Drei Becher enthalten Konditionierlösungen in aufsteigender Polarität von Toluol über Isopropanol zu Wasser; im letzten Becher findet die Titration statt. Eine Absaugvorrichtung befördert die titrierte Probenlösung oder die Spülflüssigkeit in den Abfall (Abbildung 2). Dadurch ist der Becher nach jeder Titration sauber und für die nächste Analyse bereit. Das vermeidet Probenverschleppungen.</p>


<h2>Flexibles Pipettieren</h2>
<p> Je höher die Viskosität der Probe, desto langsamer saugt der Pipettierautomat sie an. Bei hochviskosen Proben wartet er nach dem Ansaugen noch etwas, damit die Probe vollständig nachfließt. Zu pipettierendes Probenvolumen, Ansauggeschwindigkeit und Zeit zwischen Ansaugen und Weiterarbeiten lassen sich in der Methode flexibel einstellen, der optimierte Pipettiervorgang verkürzt die Analysenzeit auf maximal sechs Minuten.</p>
<p>Wie metrologische Messungen bestätigen, genügt die Dosiergenauigkeit des Pipettierautomats den Anforderungen der ISO-Norm 8655—3 für Büretten-Dosiersysteme, gleichgültig ob er 50, 1 oder 0,05 mL pipettiert (Tabelle).</p>


<h2>Alles automatisch</h2>
<p>Vor der Titration kalibriert sich der Sensor mit Puffer, das System bestimmt und speichert den Blindwert des Lösemittelgemischs. Das System titriert die Probe auf den Endpunkt von pH 11, berechnet die Säurezahl der Probe und befördert die Lösung in den Abfall. Sensor und Zubehör werden anschließend mehrmals mit dem Lösemittelgemisch gereinigt, die Spüllösung verworfen. Der Sensor konditioniert sich dann im Lösungsmittelgemisch, in Isopropanol und in Wasser — als Reinigung und zur Wiederherstellung der Hydratschicht der pH-empfindlichen Membran. Dadurch erhöht sich die Lebensdauer des Sensors. Das System spült den Titrierbecher kurz mit dem Lösungsmittelgemisch, um anhaftendes Wasser abzuspülen. Dann geht's weiter mit der nächsten Probe. Ölproben, die sich wegen ihrer hohen Viskosität nicht pipettieren lassen, werden direkt in den Titrierbecher eingewogen.</p>
<p><b>Hans-Joachim Muhr</b> studierte technische Chemie an der Universität Stuttgart und hat einen PhD in anorganischer Chemie der ETH Zürich. Er ist seit 1999 bei Mettler-Toledo beschäftigt und arbeitet als Manager der Market Support Group Anachem &amp; pH Lab. Das Team ist verantwortlich für Applikationsentwicklung und Wissenstransfer bei Titration und elektrochemischen Instrumenten. <i><a href="mailto:labor.dz@mt.com">labor.dz@mt.com</a></i></p>


<h2>— — — Kurz notiert</h2>


<h2>Momentaufnahmen durch Röntgenblitze</h2>
<p>Wissenschaftler untersuchten Kristallstrukturen mit einem Freie-Elektronen-Laser (FEL) und erzielten Momentaufnahmen ohne Artefakte. Wellenlängen bis zu sieben Nanometer und FEL-Strahlungspulse von zehn bis fünfzehn Femtosekunden haben schnell schaltbare Nanokristalle gefilmt.</p>
<p>Die hochenergetische Röntgenstrahlung erreicht hohe Auflösungen der Kristalle, aber zerstört auch einige Teilchen — durch die kurze Pulslänge misst der FEL das Molekül, bevor der Zerstörungsprozess eintritt. Die Forscher hoffen, zukünftig auch kleine Strukturänderungen molekularer Wirkstoffe oder Proteine in Aktion filmen zu können. Beteiligt sind die Max-Planck-Gesellschaft, das European XFEL, die Universität Göttingen und das Deutsche Elektronen-Synchrotron.</p>


<h2>Wettbewerb: Wer hat das schönste Nanobild?</h2>
<p>Anwender von Zeiss Elektronen- und Ionenmikroskopen können bis zum 29. August elektronenmikroskopische Bilder für den ersten Carl- Zeiss-Nanobildwettbewerb einreichen. Die Bilder müssen mit einem Partikelstrahlfiltersystem erstellt und jünger als zwei Jahre sein. Bewerten kann die Bilder jeder online. Gewinner erhalten eine cinemizer Plus Videobrille.</p>
<p> <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.smt.zeiss.com/nanocontest" target="_blank">www.smt.zeiss.com/nanocontest</a></ext-link></p>
<p><i>Julia Sachs, Frankfurt</i></p>



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