Blickpunkt

Public-Private-Partnership-Programme schließen eine Lücke: Sie setzen Erkenntnisse aus der akademischen Forschung mit kleinen und mittelständischen Unternehmen (KMU) und der Großindustrie zu Produkten um [Nachr. Chem. 2013, 61, 104]. Eine dieser Initiativen ist die European Lead Factory (ELF). Sie soll die pharmazeutische Wirkstoffforschung in Europa beschleunigen und zu einer Substanzbibliothek führen, die sowohl die Projektpartner als auch andere Forschungsinstitutionen und Unternehmen nutzen dürfen.
Das ELF-Konsortium besteht aus 30 Organisationen. Ein Bestandteil dieses Projekts, das auf fünf Jahre angelegt ist, ist die Wirkstoffsynthese. Sie vereint Medizinal- und Synthesechemiker aus Praxis und Forschung in einer virtuellen Synthesefabrik. Sieben KMU erstellen darin mit akademischen Partnern aus Deutschland, Dänemark, Frankreich, Großbritannien, den Niederlanden und Ungarn eine öffentliche Substanzbibliothek. Als Konsortialführer Chemie hat das Dortmunder Unternehmen Taros Chemicals drei Aufgaben: Es synthetisiert Wirkstoffteile, organisiert Aufrufe an die chemische Community, pharmakologisch innovative chemische Strukturen einzureichen und liefert mit “Taros Gate” die IT-Infrastruktur, um die Prozesse zu steuern, Daten zu speichern und das geistige Eigentum zu sichern.


<h2>Neue Substanzbibliotheken</h2>
Pharmazeutische Unternehmen verfügen über umfangreiche Substanzbibliotheken, die sie nach potenziellen Wirkstoffen screenen. Im Regelfall ist der Zugang zu solchen internen Bibliotheken limitiert und für Dritte außerhalb des Unternehmens nicht üblich.
Als Teil der ELF liefern sieben Pharmaunternehmen 300 000 chemische Verbindungen aus ihren Beständen. Darunter sind Bayer, Astrazeneca und Sanofi — alle drei sind Mitglieder der europäischen Vereinigung der pharmazeutischen Industrie (European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations, Efpia). Chemisch überlappen die Verbindungen der einzelnen Unternehmen bisher kaum. Die KMU und ihre akademischen Forschungspartner entwickeln eine Substanzbibliothek mit voraussichtlich 200 000 neuen Verbindungen. Die zusammengeführte Bibliothek wird also etwa 500 000 Verbindungen enthalten.
Die neuen Substanzen müssen einen chemischen Raum bilden, der sich sowohl von den Substanzbibliotheken der Efpia-Partner als auch von kommerziellen Substanzbibliotheken unterscheidet. Die Verbindungen müssen zudem medizinchemisch oder -biologisch relevant und pharmakologisch unbedenklich sein. Ein weiteres Kriterium ist die ökonomisch vertretbare Herstellung. Mit diesen Kriterien sichert das Library Selection Committee innerhalb des ELF die Qualität der Bibliotheken.


<h2>Einreichen und bewerten lassen</h2>
Im ersten Jahr kamen die Vorschläge für die Substanzbibliotheken ausschließlich aus den Reihen der Konsortialmitglieder. Ab dem Jahr 2014 soll die gesamte organisch- und medizinchemische Community Vorschläge einreichen. Eine webbasierte Software mit einem speziell designierten Call Manager steuert diese Crowd-Sourcing-Initiative.
Das Webportal akzeptiert chemische Grundgerüste in verschieden Datenformaten. Es lassen sich nicht nur Formeln, sondern auch experimentelle Vorschriften und Messdaten elektronisch einreichen. Damit sind Projekte mit einem hohen Reifegrad schneller zu implementieren und Redundanzen vermeidbar. Eine Software vergleicht die eingereichten mit kommerziell erhältlichen Substanzen und denen in den Efpia-Subtanzbibliotheken, um Neuheiten zu erkennen.
Die Filterkriterien des Webportals legt ein Selektionskomitee fest. Auch hierin sind alle Interessensgruppen vertreten: Universitäten, Efpia- und KMU-Repräsentanten sowie das Screening Center des ELF. Sie evaluieren die Kriterien jährlich und bewerten die eingereichten Vorschläge nach dem Filtern. Sollte das Komitee einen Vorschlag ablehnen, erhält der Urheber einen Kommentar und kann seinen Vorschlag nachbessern und erneut einreichen. Einen akzeptierten Vorschlag belohnt das Konsortium je nach Reifegrad mit bis zu 5000 Euro.
Dimitrios Tzalis, Jahrgang 1967, Chemiker und Biologe, studierte in Marburg und in Muncie, IN/USA. Er promovierte in Chicago und San Diego in Chemie. Im Jahr 1999 gründete er Taros Chemicals. Tzalis ist Leiter des europäischen Chemie-Konsortiums der European Lead Factory (ELF) und Mitglied im ELF-Projekt Executive Board. <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.europeanleadfactory.eu" target="_blank">www.europeanleadfactory.eu</a></ext-link>


<h2>Gegen das Damoklesschwert</h2>
Frage 71: Wir verkaufen seit einiger Zeit Spezialpräparate für die Oberflächenbehandlung. Im Zusammenhang mit einem möglichen Großauftrag hat uns nun der potenzielle Kunde mit einer Patentanmeldung der Konkurrenz konfrontiert: Die europäische Patentanmeldung beschreibt ein neues Verfahren zur Herstellung der Hauptkomponente unseres Produkts. Nach den Ansprüchen wird aber nicht nur dieses neue Verfahren, sondern auch die Substanz als solche beansprucht. Eine Recherche des Patentamtes liegt noch nicht vor. Nach unserer eigenen Recherche scheint das Verfahren tatsächlich neu zu sein, die durch das Verfahren hergestellte Verbindung ist aber bereits vor Jahren in der Fachliteratur erwähnt worden. Unser potenzieller Kunde zögert nun mit der Bestellung. Was können wir tun?
Antwort:
Zunächst scheint Ihr Problem zu sein, dass weder Sie, noch Ihr Kunde wissen, ob, wann und in welcher Form das Patent erteilt wird. Das verunsichert Ihren Kunden, der nicht weiß, ob er in Zukunft durch Nutzung Ihres Produkts möglicherweise eine Patentverletzung begeht. Idealerweise wird das Patentamt irgendwann die “richtige” Literaturstelle finden und die Substanzansprüche zurückweisen. Die Ansprüche auf das Verfahren könnten erhalten bleiben, würden aber Ihren Verkauf nicht stören, sofern Ihr Produkt nicht nach dem neuen Verfahren hergestellt ist.
Da Sie aber nicht wissen, ob das Patentamt die Literaturstelle findet und wann dies der Fall sein wird und somit die Patentanmeldung wie ein Damoklesschwert über Ihnen hängt, ist wohl Ihre einzige Möglichkeit, einen “Einwand Dritter” einzureichen: Sie können in einer Eingabe an das Europäische Patentamt die entgegenstehende Literatur nennen und erklären, warum die Patentanmeldung nicht in der angemeldeten Form erteilt werden darf.
Das Patentamt muss diese Einwände dem Patentanmelder zur Kenntnis bringen und natürlich dessen Sicht der Dinge hören. Auf diese Weise ist aber in jedem Fall sichergestellt, dass sich die entscheidende Literaturstelle in der Prüfungsakte befindet.
Der Nachteil dieser Vorgehensweise ist, dass Sie an dem weiteren Prüfungsverfahren nicht beteiligt sind und daher keine weiteren Eingaben machen können.
Einwendungen Dritter eignen sich eigentlich nur dann, wenn der Sachverhalt, d. h. die Relevanz der gefundenen Literaturstelle für die angemeldete Erfindung klar und eindeutig hervorgeht. Da solche Einwendungen von jedem eingereicht werden können, brauchen Sie dabei nicht selbst in Erscheinung zu treten, der Einwand kann auch durch eine beliebige andere Person erfolgen. Allerdings: Mit Ihrem Kunden müssen Sie in jedem Fall über die Situation und die Bedeutung Ihres Fundes reden. Selbst wenn die Literaturstelle klar und eindeutig ist, kann es noch Jahre dauern, bis die Patentanmeldung endgültig zurückgewiesen ist.
Fragen für Thomas Seuß an: nachrichten@ <a href="https://gdch.de" target="_blank">gdch.de</a>. Info zur kostenfreien Beratung unter <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://www.gdch.de/rechtsberatung" target="_blank">www.gdch.de/rechtsberatung</a></ext-link>

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Gemeinsam mehr Wirkstoffe

Public-Private-Partnership-Programme schließen eine Lücke: Sie setzen Erkenntnisse aus der akademischen Forschung mit kleinen und mittelständischen Unternehmen (KMU) und der Großindustrie zu Produkten um [Nachr. Chem. 2013, 61, 104]. Eine dieser Initiativen ist die European Lead Factory (ELF). Si...

Das Mykotoxin Zearalenon (ZON) ist ein Stoffwechselprodukt verschiedener Fusarien-Schimmelpilzarten und kommt auf fast allen Getreidearten vor. Seine akute Toxizität ist zwar gering, allerdings verursachte ZON im Tierversuch Fehlbildungen bei Embryonen, schädigte Immunsystem, Leber sowie Erbgut und wirkte krebserregend.1—3 Durch seine Östrogenwirkung beeinflusst ZON die Tumorbildung in hormonell empfindlichem Gewebe.
Galt in der Vergangenheit Getreide als Hauptquelle für ZON, so haben aktuelle Studien insbesondere Mais-, Weizen- und Sojakeimöle als Quellen identifiziert.4 Das führte dazu, dass die EU für raffiniertes Maisöl einen Grenzwert von 400 μg ZON·kg—1 erlassen hat.5
ZON ist lipophil und löst sich hervorragend in Pflanzenölen. Daher liegen die ZON-Gehalte in Speiseölen teilweise um ein Vielfaches höher als in festen Getreideerzeugnissen. In Maiskeimölen wurden die mit Abstand höchsten ZON-Gehalte von bis zu 4600 μg·kg—1 gemessen. Hinzu kommt die hohe Anzahl positiv getesteter Speiseölproben: In etwa 60 % aller untersuchten Ölproben war ZON nachweisbar.6
Gegenwärtig existiert kein genormtes Verfahren für die ZON-Bestimmung in Speiseölen. Es gibt Bestrebungen der EU, ein standardisiertes Verfahren zu entwickeln (CEN-Mandat 520/2013). Es gibt unterschiedliche Ansätze sowohl in der Probenvorbereitung als auch in der Analytik. Gefordert ist eine möglichst schnelle, schonende, preiswerte und leicht zu automatisierende Methode. Bisherige Ansätze erfüllten die Anforderungen jedoch nicht.


<h2>Analytik einer Ölmatrix</h2>
Um den ZON-Gehalt zuverlässig quantitativ zu bestimmen, ist die Ölmatrix zu entfernen. Mit einem Triglyceridanteil von 95 bis 98 % sind Speiseöle eine extrem unpolare Matrix, sodass es schwierig ist, das unpolare ZON abzutrennen. Die klassischen Flüssig-Flüssig- oder Festphasen-Extraktionen zur Probenvorbereitung funktionieren aufgrund ähnlicher Polaritätswerte von Zielsubstanz und Ölmatrix für die Quantifizierung nur unzureichend.
Die bisher entwickelten Techniken zur Probenvorbereitung von ZON aus Speiseöl sind kosten- und zeitaufwendig oder nicht selektiv genug. Zur Anwendung kommen Gel-Permeations-Chromatographie, Immunoaffinitäts-Chromatographie, Flüssig-Flüssig-Extraktion bei pH 9 oder eine Kombination dieser drei Methoden. Die oft nicht ausreichende Abtrennung der Ölmatrix führt zu Störungen in der Analytik.
Quantitativ bestimmt werden kann der ZON-Gehalt mit HPLC-MS/MS, idealerweise mit einem internen Standard, oder — in der Routineanalytik bevorzugt — durch HPLC mit Fluoreszenzdetektion, die deutlich preiswerter ist.


<h2>Ein neuer Lösungsansatz: Chemiesorption</h2>
Ein neues Probenvorbereitungsverfahren haben Siegel et al. an der Bundesanstalt für Materialprüfung- und -forschung, BAM, entwickelt und in der Ausführung als Batch-Technik veröffentlicht.7
Das Verfahren beruht auf der Bildung einer reversiblen Bindung zwischen dem Zielanalyten ZON und einer reaktiven chemischen Gruppe auf einer Festphase. Die Reaktion fixiert den Analyten an der Festphase, und die Matrix mit den nichtreaktiven Verunreinigungen lässt sich abtrennen.
Das Trägermaterial ist mit einer Hydrazingruppe funktionalisiert, die mit der Ketogruppe am C7-Atom des ZON zu einem Hydrazon reagiert. Um den Analyten freizusetzen, wird die Hydrazonbindung hydrolysiert und so der chemisch unveränderte Analyt zurückgewonnen (Abbildung 1). Die Literatur benennt dieses Verfahren als dynamisch kovalente Hydrazinchemie (DCHC).7
Die Triglyceride im Öl haben keine freistehenden Keto- oder Aldehydgruppen, die für die Reaktion mit Hydrazin erforderlich sind. Daher erzielt das Verfahren eine sehr hohe Selektivität. Aufgrund der Reversibilität der Hydrazin-Hydrazon-Reaktion lässt sich die hydrazinfunktionalisierte Festphase regenerieren und mehrfach verwenden.


<h2>Weiterentwicklung zur Online-SPE</h2>
BAM und Wissenschaftliche Gerätebau Dr. Ing. Herbert Knauer haben in einem Kooperationsprojekt ein automatisches SPE-HPLC-Kopplungsverfahren auf Basis der von Siegel beschriebenen Hydrazinchemie entwickelt. Die größte Herausforderung war dabei, das manuell durchgeführte Batchverfahren mit der 60-minütigen Gleichgewichtseinstellung von Kopplungs- und Abspaltungsreaktion in ein automatisches Online-Verfahren zu überführen. Normalerweise nutzt die Online-SPE keine chemischen Reaktionen, sondern Physisorption, bei der sich ein Gleichgewicht innerhalb weniger Sekunden einstellt. Aus diesem Grund erforderte die ZON-Bestimmung in Speiseölen eine neue Herangehensweise (Abbildung 2). Dabei wird die Probe im Kreislauf mehrmals über die Hydrazinkartusche (rote Pfeile in Abbildung 2) gefördert.
Nach der Kopplung des ZON an der Hydrazinfestphase öffnet sich das Kreislaufventil, so dass verschiedene Lösungen über das Lösungsmittelauswahlventil angesaugt und durch das System gefördert werden können. Ein vorher ausgewähltes, passendes Lösungsmittel spült die Ölmatrix aus dem System, welches danach auf wässrig-organische Eluenten umgestellt wird (grüne und rote Pfeile ohne graue C18-Trap-Kartusche in Abbildung 2). Während der ZON-Kopplung und des Waschens der Kartusche fördert die HPLC-Pumpe eine niedrige Flussrate durch die C18-Trap-Kartusche und die analytische C18P-Säule, damit beide arbeitsbereit bleiben (violette Pfeile mit grauer C18-Trap-Kartusche in Abbildung 2).
Vor der ZON-Abspaltung wird die C18-Trap-Kartusche in den Probenkreislauf geschaltet (grüne und rote Pfeile mit grauer C18-Trap-Kartusche in Abbildung 2). Zum Abspalten dient verdünnte Acetonlösung. Das Aceton verdrängt das ZON von der Hydrazinkartusche und bindet mit seiner Carbonylgruppe an diese Phase. Das freigesetzte ZON wird auf der C18-Trap-Kartusche aufgefangen und konzentriert (grüne und rote Pfeile mit grauer C18-Trap-Kartusche in Abbildung 2). Dieser zweite Bearbeitungsschritt entspricht einer klassischen Online-SPE-Anwendung mit Physisorption.
Vor der analytischen Messung ist das Aceton aus der C18-Trap-Kartusche zu spülen, um Basislinienprobleme zu vermeiden. Anschließend wird die C18-Trap-Kartusche in das HPLC-System zurückgeschaltet, was einer Injektion entspricht (violette Pfeile mit grauer C18-Trap-Kartusche, Abbildung 2). Die HPLC-Pumpe beginnt zu diesem Zeitpunkt, einen Gradienten aus Wasser und Acetonitril zu fördern. Dabei wird das auf der C18-Trap-Kartusche konzentrierte ZON wieder eluiert und auf der analytischen C18P-Säule chromatographisch getrennt. Ein Fluoreszenzdetektor registriert das ZON (Anregung: 276 nm, Emission: 456 nm).
Während der analytischen Bestimmung von ZON wird die Hydrazinkartusche regeneriert und somit für die nächste Messung vorbereitet. Dieser Zyklus ist mit derselben Hydrazinkartusche 10 bis 15 Mal möglich. Durch eine spezielle Ventilanordnung lässt sich die Hydrazinkartusche unabhängig von der HPLC-Trennung regenerieren.
Für die Analytik wird eine 150 × 3-mm-Eurospher-II-100—5-C18P-Säule verwendet. Dies ist eine hoch belegte Phase mit einer sehr guten planaren Selektivität (Shape Selectivity), die trans- und cis-ZON trennt. Letzteres entsteht durch Lichteinwirkung, wodurch die natürliche trans-Form isomerisiert.
Das neue Verfahren ist den klassischen Probenvorbereitungsmethoden beim Detektionslimit (15 µg·kg—1 bei einer Injektion von 100 µL Speiseölprobe) ebenbürtig. Im Unterschied zu den existierenden Methoden reichert es ZON hochselektiv an, ist vollständig automatisiert und günstiger bei den Betriebskosten. Das Detektionslimit kann durch höhere Injektionsvolumina gesteigert werden, da das ZON aus der Probe angereichert wird.
Zur Kontrolle der neuen Methode diente ein in Methanol gelöster ZON-Standard, der Wiederfindungsraten von 95 % erreicht. Bei Speiseöl, zum Beispiel Maiskeimöl, lag die Wiederfindungsrate bei 80 % und entspricht damit den EU-Anforderungen an Analyseverfahren von 70 bis 120 % Wiederfindungsrate.8 Kontrollen mit unbelastetem Speiseöl zeigen keine unspezifischen Peaks im Fluoreszenz-Chromatogramm (Abbildung 3).
Das vorgestellte Verfahren eignet sich für die Bestimmung von ZON in Speiseölen bei Gehalten zwischen 20 und 1200 µg·kg—1. Das DCHC-Prinzip funktioniert auch mit anderen carbonylhaltigen Analyten sowie mit flüssigen Lebensmittelmatrices. Erste Versuche zur Bestimmung von ZON in Bier verliefen erfolgreich.
Stefan Weiz hat Biotechnologie studiert und in Chemie promoviert. Seit dem Jahr 2011 ist er Applikationschemiker und Produktmanager für Säulen bei Wissenschaftliche Gerätebau Dr. Ing. Herbert Knauer in Berlin.
Silvia Marten ist promovierte Chemikerin und leitet seit dem Jahr 2003 die Abteilung Säulen, Phasen und Applikationen bei Wissenschaftliche Gerätebau Dr. Ing. Herbert Knauer.
<a href="mailto:marten@knauer.net">marten@knauer.net</a>
Julia Heinze hat Pharma- und Chemietechnik studiert und das Projekt durch ihre Masterarbeit bei Knauer unterstützt.
Sarah Drzymala hat Biotechnologie studiert und ist seit dem Jahr 2011 Doktorandin im Fachbereich Lebensmittelanalytik an der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM).
Matthias Koch ist promovierter Chemiker und leitet den Fachbereich Lebensmittelanalytik an der BAM.
<a href="mailto:matthias.koch@bam.de">matthias.koch@bam.de</a>


<h2>QUERGELESEN</h2>
Das Schimmelpilzgift Zearalenon lässt sich in Speiseöl nur ohne die Ölmatrix zuverlässig quantifizieren. Die klassischen Fest-Fest- oder Fest-Flüssig-Extraktionsverfahren funktionieren hier aber nicht.
Eine neue Lösung nutzt für die Festphasenextraktion die Reaktion des Analyten mit Hydrazin, bei der sich das Gleichgewicht allerdings recht langsam einstellt.
Damit die Extraktion trotz der langsamen Gleichgewichtseinstellung gelingt, führt die automatisierte Probenvorbereitung die Probe im Kreislauf mehrmals über eine Hydrazin-kartusche.



<ul>
<li>
1 


W. Mücke, 
Ch. Lemmen, 
<source>Schimmelpilze. Vorkommen, Gesundheitsgefahren, Schutzmaßnahmen, <publisher-name>Ecomed Verlag</publisher-name>, <publisher-loc>Landsberg am Lech</publisher-loc>, 2004.

</li>
<li>
2 

 
A. Zinedine, 
J. M. Sorianoet, 
J. C. Moltó, 
J. Mañes, 
<source>Food and Chemical Toxicology 
(2007), 
45, 
1–<lpage>18.</lpage>
</li>
<li>
3 


M. Weidenbörner, 
<source>Encyclopedia of Food Mycotoxins, <publisher-name>Springer</publisher-name>, <publisher-loc>Berlin</publisher-loc>, 2001.

</li>
<li>
4 

 
O. Kappenstein, 
H. Klaffke, 
I. Mehlitz et al., 
<source>Mycotoxin Research 
(2005), 
21, 
3–<lpage>6.</lpage>
</li>
<li>
5 

Verordnung (EG) Nr. 1126/2007 der Kommission vom 28. September 2007 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 1881/2006.
</li>
<li>
6 

BMELV, Abschlussbericht zu Verbundforschungsprojekt 00HS 055, 2005.
</li>
<li>
7 


D. Siegel, 
K. Andrae, 
M. Proske, 
<source>Journal of Chromatography A, 
2010, 
1217, 
2206–<lpage>2215.</lpage>

</li>
<li>
8 

Verordnung (EG) Nr. 401/2006 der Kommission vom 23. Februar 2006 zur Festlegung der Probenahmeverfahren und Analysemethoden für die amtliche Kontrolle des Mykotoxingehalts von Lebensmitteln.
</li>
</ul>

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