Wissenschaft + Forschung

Ulrich Markel nutzt Protein-Engineering-Methoden, um aus natürlichen Enzymen künstliche Metalloenzyme und proteinbasierte Materialien zu entwickeln.Längst haben Synthesechemiker:innen Enzyme für ihre Arbeit entdeckt und ziehen diese bei der Syntheseroutenplanung immer häufiger in Betracht.1,2) Um natürlich vorkommende Enzyme an die Anforderungen eines Prozesses hinsichtlich Aktivität, Selektivität und Stabilität anzupassen, gibt es mehrere Ansätze.Eine Methode, die spätestens seit dem Nobelpreis für Chemie im Jahr 2018 allgemein bekannt ist, ist gelenkte Evolution (directed evolution). Dabei werden in einem iterativen Trial-and-error-Prozess zufällige Enzymvarianten generiert und via Hochdurchsatzscreening die vielversprechendsten Kandidaten identifiziert (<link href="#nadc20224125413-fig-0001">Abbildung A, blauer Zyklus).3)<figure xml:id="nadc20224125413-fig-0001"><figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/UMR3dj1TwajO48IN9iZS"><figcaption><label>Abb.1: </label>Gelenkte Evolution (directed evolution) nutzt iterative Zyklen aus Mutagenese und Hochdurchsatzscreenings, um verbesserte Varianten zu identifizieren (A, blauer Zyklus). Indem Proteine mit synthetischen Metall-Cofaktoren kombiniert werden, lassen sich darüber hinaus künstliche Metalloenzyme (artificial metalloenzymes, ArM) herstellen (A, rote Erweiterung des Zyklus). Dadurch ergeben sich neue Startpunkte für Evolutionskampagnen, die durch die Kombination von Proteinvarianten und Cofaktoren mehr Freiheitsgrade haben (B).</figcaption></figure></figure>Ein Evolutions-Experiment erfordert zweierlei: ein Screening-System, um in kürzester Zeit (Minuten bis Stunden) tausende Enzymvarianten zu evaluieren, und ein geeignetes Enzym als Startpunkt.4)<h2 type="main">Photoclick-basiertes Screening</h2>Auch wenn Enzyme bereits seit fast 30 Jahren über diese Evolution im Reagenzglas optimiert werden, gibt es immer noch Enzymklassen, für die kein effizientes Screening-System existiert. Ein Beispiel dafür sind die Decarboxylase OleT und ihre Verwandten. Im Gegensatz zu klassisch chemischen Decarboxylierungsmethoden wandeln diese Enzyme Carbonsäuren in terminale Alkene um, ohne dabei stöchiometrische Mengen an Schwermetallsalzen oder andere unerwünschte Nebenprodukte zu produzieren.Bisher mussten OleT-Varianten aufwendig einzeln isoliert und über chromatographische Methoden charakterisiert werden. Wir haben uns daher von einer Strategie inspirieren lassen, die Song und Kolleg:innen ursprünglich als Proteinlabeling-Methode konzipiert hatten:5) Auf Basis dessen haben wir ein photoclickbasiertes Screening entwickelt.6) Dabei reagiert ein Diaryltetrazol unter UV-Licht mit den Styrolderivaten, die von OleT-Varianten produziert wurden, zu einem fluoreszierenden Addukt.Damit ließen sich in einem konventionellen Mikroplattenleser 96 Enzymvarianten gleichzeitig auf ihre Decarboxylase-Aktivität hin untersuchen. Nach dem Screening einer Mutantenbibliothek haben wir so zwei OleT-Varianten identifiziert, deren Substratpräferenz von langkettigen Fettsäuren – den natürlichen Substraten dieses Enzyms – hin zu aromatischen Carbonsäuren verschoben war.Dieses Hochdurchsatzscreening wird ermöglichen, OleT und andere Decarboxylasen über gelenkte Evolution zu optimieren und so dabei helfen, diese Enzymklasse für nachhaltige Anwendungen in der Industrie nutzbar zu machen. Gleichzeitig hebt es hervor, wie wichtig es ist, für neu entdeckte, synthetisch relevante Enzymklassen immer neue Screeningansätze zu entwickeln.<h2 type="main">Künstliche Metalloenzyme</h2>Eine weitere Schwierigkeit für die gelenkte Evolution ist, den besten Startpunkt zu finden – welcher bietet das größte Optimierungspotenzial? Da die aktiven Zentren natürlicher Enzyme bereits von Natur aus für eine bestimmte Reaktion optimiert sind, könnten diese im ungünstigsten Fall in einem lokalen Optimum gefangen sein. Gelenkte Evolution identifiziert jedoch nur verbesserte Varianten. Verschlechterungen, die für das Entkommen aus einem lokalen Optimum zumindest vorübergehend nötig wären, sind also nicht vorgesehen.Künstliche Metalloenzyme (artificial metalloenzymes, ArMs) eröffnen in dieser Hinsicht eine spannende Alternative.7,8) Indem ein synthetischer Metall-Cofaktor in ein Protein eingebettet wird, lassen sich neue Startpunkte für die gelenkte Evolution schaffen (Abbildung A, rote Erweiterung des Directed-evolution-Zyklus). Da Protein und synthetischer Cofaktor keine gemeinsame evolutionäre Vorgeschichte haben, ist das Protein evolutionär unvoreingenommen gegenüber dem neuen Cofaktor und erinnert in gewisser Weise an die urzeitlichen Vorfahren heutiger Metalloenzyme.Darüber hinaus erweitert sich der Raum, in dem wir navigieren können: Nun können wir nicht nur die Aminosäuresequenz des Proteins optimieren, sondern auch die Art des Cofaktors (Abbildung, B).Durch diese neue Art der chemogenetischen Evolution entstanden zum Beispiel künstliche Peroxidase-ähnliche Enzyme und Epoxygenasen.9,10) Mit dem Ziel, einen möglichst unvoreingenommenen Startpunkt für unsere Evolutionskampagne zu wählen, stellten wir eine Variante des Proteins Nitrobindin mit hydrophober Bindetasche her.Diese erwies sich nach Einbau eines Mangan-Protoporphyrin-IX-Komplexes als bemerkenswert evolvierbar: Nach zwei Runden gelenkter Evolution zeigte das Mn-basierte ArM eine katalytische Aktivität auf dem Niveau natürlicher Peroxidasen. Interessanterweise blieb diese evolutionäre Entwicklung dem Protein verwehrt, als wir Wildtyp-Nitrobindin anstelle der Variante mit hydrophober Tasche als Startpunkt verwendeten. Dies unterstreicht das Potenzial von ArMs für gelenkte Evolutions-Experimente, gemahnt aber auch, den Startpunkt sorgsam zu wählen.<h2 type="main">Drei Fragen an den Biokatalyse-Preisträger: Ulrich Markel</h2>Wie sieht der für Sie ideale Morgen aus?Auch wenn ich dafür vielleicht früher aufstehen muss, darf ein entspanntes Frühstück auf keinen Fall fehlen – am liebsten natürlich gemeinsam mit meiner Frau und meinem Sohn.Meine besten Ideen kommen mir beim …… Lesen wissenschaftlicher Publikationen. Andere Wissenschaftler haben andere Blickwinkel, die helfen, eine eigene Fragestellung aus einer neuen Perspektive zu betrachten. Insbesondere in interdisziplinären Forschungsfeldern finde ich ein solches thinking outside the box hilfreich.In einer freien Stunde …… lasse ich mich gerne von meinem Sohn (drei Jahre alt) und seiner Begeisterung, immer wieder Neues zu lernen, anstecken.Ulrich Markel forscht zurzeit als Walter-Benjamin-Postdoc-Fellow an der University of California, San Diego, in der Arbeitsgruppe von F. Akif Tezcan. Bei der Orchem 2022 in Münster erhält er den GDCh-Preis für Biokatalyse.<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/Eg1iTLSue6e2nmM8wolQ"><ul class="references" xml:id="nadc20224125413-bibl-0001" cited="no" style="numbered"><li xml:id="nadc20224125413-bib-0001">1 U. Hanefeld, F. Hollmann, C. E. Paul, Chem. Soc. Rev. 2022, 51, 594–627</li><li xml:id="nadc20224125413-bib-0002">2 W. Finnigan, L. J. Hepworth, S. L. Flitsch et al., Nat. Catal. 2021, 4, 98–104</li><li xml:id="nadc20224125413-bib-0003">3 F. H. Arnold, Angew. Chem. Int. 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Artikel

Evolution im Reagenzglas

Ulrich Markel nutzt Protein-Engineering-Methoden, um aus natürlichen Enzymen künstliche Metalloenzyme und proteinbasierte Materialien zu entwickeln.Längst haben Synthesechemiker:innen Enzyme für ihre Arbeit entdeckt und ziehen diese bei der Syntheseroutenplanung immer häufiger in Betracht.1,2) Um...

Schlaglichtthema: Chemie in Europa

Due to their excellent optoelectronic performance, and relatively easy processibility, halide perovskite semiconductors are used in highly efficient solar cells, LEDs, X-ray detectors, and more recently in photo(electro)chemistry. Eline M. Hutter aims to obtain stable, non-toxic perovskites for photoconversion applications.
What intrigues me most about halide perovskites is their compositional tunability,1,2) allowing to manipulate the properties depending on the desired application. This compositional tunability originates from the ionic nature of halide perovskites, allowing to build in any cation or anion as long as geometric and charge constraints are obeyed. At present, methylammonium- or formamidinium lead iodide perovskites yield the highest efficiencies in single junction solar cells3) due to their suitable bandgaps of ~1.6 eV. However, for multi-junction solar cells, LEDs, or photochemistry, larger bandgaps may be desired. For that, iodide is replaced with smaller halides like bromide or chloride to enlarge the bandgap, or even mix several halides to precisely tune the light absorption and emission in the entire visible region (i.e. between 2.9 and 1.6 eV).1,2)
<figure xml:id="nadc20224127355-fig-0001">
<figure><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/lLF1jueTmA7pAY5ym7kg" />
<figcaption><label>Abb.1: </label>What can be done with halide perovskite semiconductors.</figcaption>
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</figure>
An ongoing challenge with these mixed-halide perovskites is to maintain phase-stability, as the halides tend to segregate under illumination conditions.4) This segregation leads to inhomogeneous materials containing regions with different bandgaps. As the electrons tend to funnel to the lower bandgap regions, segregation leads to losses in open-circuit voltage (VOC) in solar cells, and reduced colour purity of LEDs.5) Although phase segregation is in itself not uncommon in materials science,6) the reversibility of this phenomenon seems to be unique to halide perovskites, and is still poorly understood.
<h2 type="main">Phase segregation</h2>
Aiming to better understand the thermodynamics and kinetics of phase segregation, we have investigated this process under high external pressure with spectroscopic techniques.7,8) By using ultrafast (sub-ns) transient absorption spectroscopy measurements it was possible to follow both the regions with high bandgap, enriched in bromide, and those with low bandgap, enriched in iodide. This led to a more complete picture than previous photoluminescence-based studies that could only probe the low-bandgap phase. On applying external pressure to the system, segregation decreased on compressing the perovskites, and even became completely absent at 0.4 GPa (i.e. 4000 bar).
Why is phase segregation suppressed at high pressure? We suspect that both kinetics and thermodynamics play a key role here. The kinetic role can be understood from the idea that segregation requires the anions to migrate, which is a thermally activated process with a certain activation energy.9) At high pressure, the crystal structure is more closely packed, so that the energy barrier for ions to move is higher. As a consequence, ion migration is less likely and segregation slows down on compressing the perovskite.7) The thermodynamics of phase segregation can be reasoned by considering the entropy and enthalpy of mixed halide perovskites. Entropically, mixing is favoured, whereas the enthalpy drives segregation because mixing anions leads to strain in the material. At high pressure, the strain is less, so that the entropy term overrules the enthalpy and mixed-halide perovskites are stable.8)
A similar stabilizing effect was achieved by compressing the perovskite chemically. Instead of pressurizing the perovskite from the outside, the lattice was contracted by replacing the organic cation with smaller caesium cations. Hence, we used a chemical approach to mimic physical pressure, showing reduced phase segregation at ambient conditions.
Is it now feasible to obtain mixed-halide perovskites that are fully stable at ambient conditions? This may likely require a combination of chemical tuning and strain release through substrate and surface engineering.
<h2 type="main">Double perovskites</h2>
Another fascinating class of halide perovskites are double perovskites, with alternating monovalent and trivalent metal cations at the B-site (elpasolite crystal structure). These materials recently gained new interest when researchers from the halide perovskite community proposed the semiconductor Cs2AgBiBr6 as an alternative material with reduced toxicity compared to widely investigated lead-based perovskites (see infobox).10&ndash;12)
The presence of two metals instead of one offers a huge variety of compositions, and allows to design materials with novel features. For instance, in these double perovskites, not only the magnitude13) but also the nature of the bandgap can be tuned from direct to indirect and in-between.11,14) This allows rational design of direct-indirect semiconductors, that could be useful for applications requiring both strong absorption (direct bandgap) and slow recombination (indirect bandgap).15) Furthermore, on incorporating magnetic metals in double perovskites, these may find applications in next-generation information technologies or optomagnetic sensing.11) Finally, the design of non-toxic halide perovskites with tunable properties will be important to exploit their full potential for photo-redox chemistry.
<h2 type="main">INFO: Toxicity</h2>
The toxicity of lead is considered a potential hurdle for commercializing perovskites, especially because the 2+ oxidation state may ease its uptake by humans. However, there have been very limited toxicity studies on lead halide perovskites, and predictions are mainly based on seminal toxicity studies using lead nitrate salts. In collaboration with plant scientists, we investigated the toxicity of lead halide perovskites and its precursors on the model plant Arabidopsis Thaliana.16) On comparing the different precursors, we conclude that the iodide inhibited plant growth, before toxicity effects of lead appear. These results stress the importance of rigorous assessment on the potential harmfulness of halide perovskites, in parallel to optimizing its composition for the envisioned applications.
<h2 type="main">Three questions to the backer of the author: Markus Suta</h2>
What&lsquo;s the difference between research in Germany and the Netherlands?
In the Netherlands, research is much more interdisciplinary. In Germany, we often categorize chemical research to a higher extent (e.g. in organometallics, physical chemistry etc.) and use specifically targeted methods for that. In the Netherlands, researchers from different disciplines work on one particular research topic to contribute with different perspectives, the boundaries are smoother.
Why did you suggest Eline for an article?
Eline&rsquo;s approach for the application of halidoperovskites is very unconventional. It is also impressive that both she and her husband, Ward van der Stam, are working in research and manage to balance that with the family life with two children.
What&lsquo;s your relationship with the Netherlands?
I did my postdoc at the University of Utrecht with Andries Meijerink &ndash; one of the primary experts in the field of inorganic luminescent materials. My family and I have truly enjoyed the life in the Netherlands and the scientifically enriching atmosphere there.
Markus Suta is a junior professor at the University of D&uuml;sseldorf. Author Eline Hutter, born 1990, became a Tenure Track assistant professor at Utrecht University in 2020 after a short postdoc at NWO Institute for Atomic and Molecular Physics (AMOLF). She received her PhD in chemical engineering at Delft University of Technology. In 2017, she was a Fulbright visiting scholar at Stanford University. Her research focusses on synthesis and spectroscopy of materials for photoconversion applications. Besides doing research, Eline Hutter sings in a chamber choir and has two children.<img alt="image" src="https://media.graphassets.com/xlBMpIuPSuKvpgcvEkFb" /><img alt="image" src="https://media.graphassets.com/D5UZh4oeR66RwZnMObWx" />
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</ul>

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