Blickpunkt

Nachrichten aus der Chemie: Sie haben ein Verfahren zur Wiedergewinnung von fluorierten Monomeren entwickelt. Was macht es besonders?
Thorsten Schwalm: Das Up-Cycling schließt erstmals den Fluorpolymerkreislauf. Dadurch reduziert sich der Einsatz von R22, also Chlordifluormethan, als Ausgangsmaterial. Hierdurch wird der strategische Rohstoff Flussspat geschont, was die Umwelt entlastet.
Nachrichten: Warum nutzen Sie für Ihren Prozess den Begriff “Up-Cycling”? Die Zerlegung eines Polymers in Monomere ist doch eher ein Down-Cycling.
Schwalm: Die Ausgangsmaterialien für unser Verfahren sind entsorgungspflichtige Abfälle ohne Wert in der Wertschöpfungskette. Wir überführen diese zurück in das Monomer Tetrafluorethen, TFE. Dieses wird anschließend wieder für die Produktion neuer Fluorpolymere eingesetzt — und das bei identischen chemischen und physikalischen Eigenschaften im Vergleich zu Fluorpolymeren, welche aus TFE über die R22-Route hergestellt werden.
Nachrichten: Welche Mengen verarbeiten Sie? Und zu welchen Kosten?
Schwalm: Unsere Anlage hat eine Kapazität von 500 Jahrestonnen. Die Bestimmung der Kosten und des Energieverbrauchs sind Ziele der noch laufenden Pilotphase.
Nachrichten: Verarbeitet Dyneon die erhaltenen Monomere selbst weiter?
Schwalm: Aus den Monomeren produzieren wir bei uns am Standort neue Polymere, sie werden nicht verkauft.
Nachrichten: Woher kommen die gebrauchten Polymere?
Schwalm: Sie stammen von unseren Kunden und von Projektpartnern, zum Teil sind es Abfälle aus unserer eigenen Fluorpolymerproduktion. Prinzipiell arbeiten wir mit jedem Beitragenden zusammen, der seine entsorgungspflichtigen Abfälle bei uns up-cyclen lassen möchte. Ab einer gewissen Abfallmenge erhält der Beitragende ein Up-Cycling-Zertifikat und wird offizieller Partner.
Nachrichten: Was muss er dafür zahlen?
Schwalm: Das Up-Cycling ist derzeit kostenlos.
Nachrichten: Gibt es ähnliche Projekte, Vorbilder oder Nachahmer?
Schwalm: Nein. Wir sind das einzige Unternehmen weltweit, das diese Art von Fluorpolymer-Up-Cycling auf halbtechnischem Maßstab durchführt.
Nachrichten: Wer hatte die Idee zu dem Projekt?
Schwalm: Den Impuls für das Up-Cycling gab Anfang der 1990er Jahre der Forschungsleiter Klaus Hintzer. Ab dem Jahr 2006 erarbeiteten wir gemeinsam mit dem Lehrstuhl für Werkstoffverarbeitung der Universität Bayreuth und dem Forschungsinstitut Invertec das heutige Verfahrenskonzept.
Eliza Leusmann ist Redakteurin der Nachrichten aus der Chemie.


<h2>Up-Cycling-Prozessablauf</h2>
Beim neuen Hochtemperaturrecyclingverfahren wäscht und zerkleinert die Anlage zunächst die vollfluorierten Polymere und spaltet sie dann bei Temperaturen oberhalb von 600 °C in dieselben Monomere, aus denen die Polymere hergestellt worden waren. Hauptsächlich entstehen bei dieser Pyrolyse gasförmiges Tetrafluorethen (TFE) und Hexafluorpropen (HFP); die Wiedergewinnungsrate beträgt 90 bis 95 Prozent. Dieses Gasgemisch gelangt dann in den Reinigungstrakt der Monomeranlage des 3M-Tochterunternehmens Dyneon, die den Mix zusammen mit Rohgas aus der normalen Monomerproduktion, deren Grundlage Flussspat ist, destillativ reinigt. Das Hauptprodukt der Monomersynthese, TFE, entsteht dabei mit einer Reinheit von 99,9999 Prozent.

Einmal Flussspat — immer wieder Polymer

Nachrichten aus der Chemie: Sie haben ein Verfahren zur Wiedergewinnung von fluorierten Monomeren entwickelt. Was macht es besonders? Thorsten Schwalm: Das Up-Cycling schließt erstmals den Fluorpolymerkreislauf. Dadurch reduziert sich der Einsatz von R22, also Chlordifluormethan, als Ausgangsmate...

Im Fokus der Lebenswissenschaften steht der Mensch, der aus Billionen verschiedener Zellen mit unterschiedlichen Aufgaben besteht.1 Lebenswissenschaftler untersuchen Zellpopulationen überwiegend als Lysate, also als eine Menge. Das Ergebnis ist ein Mittelwert, der nicht die ganze Geschichte erzählt. Er lässt uns vielleicht die eine mutierte Zelle übersehen, die für die Entstehung einer Krankheit verantwortlich ist.
Um Unterschiede zwischen Zellen sichtbar zu machen und die Rolle einzelner Zellen zu verstehen, ist es notwendig, diese individuell zu analysieren. Dies erfordert eine robuste, multiplexfähige wie auch eine quantitative Analytik. Vielversprechende Techniken für dieses Forschungsfeld sind beispielsweise Fluoreszenzmikroskopie, Massenspektrometrie, bildgebende Massenspektrometrie und mikrofluidische Chips.
Neu ist ein qualitatives und quantitatives Elementmikroskop auf Basis der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma und Laserablation als Probeneintragssystem (LA-ICP-MS).2,3 Die Idee für die Entwicklung des Elementmikroskops kommt aus der Auswertung von MS-Fingerabdrücken. Zudem ist das ICP-MS ein Multielementdetektor, der viele Elemente des Periodensystems gleichzeitig bestimmt. Weitere Vorteile der Technik liegen in der hohen Genauigkeit, dem weiten linearen Messbereich sowie in den besonders niedrigen Nachweisgrenzen.


<h2>Elementmarkierungen</h2>
Bei der Analyse mit LA-ICP-MS trägt ein Laser die Probe linienweise ab und überträgt sie so in das ICP-MS. Aus den im ICP-MS analysierten Linienscans lassen sich dann zweidimensionale Intensitätsprofile erzeugen, welche die lokale Elementverteilung in der biologischen Probe wiedergeben. Dies können zum einem natürlich vorliegende Elemente wie Kupfer und Eisen, aber auch Nanopartikel sein. Zum anderen kann das Elementmarkierung sein, die künstlich eingeführt wurde. Diese dient dem indirekten Nachweis des Zielanalyten (zum Beispiel ein Protein) in der biologischen Probe.
Ein spezieller Fall ist die Entwicklung multiplexfähiger Immunoassays. Hier ist die Markierung kovalent an einen Antikörper gebunden, der wiederum an das Zielprotein (Antigen) nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip spezifisch andockt. Über die Detektion des Elements mit ICP-MS ist so das Zielprotein zu identifizieren (Abbildung 1). Der Multiplex-Immunoassay erlaubt es, viele Antigene durch den gleichzeitigen Einsatz verschieden markierter Antikörper zu analysieren.4
Der Durchmesser des Laserstrahls bestimmt die Ortsauflösung des Elementmikroskops. Gleichzeitig ist dies der Flaschenhals der LA-ICP-MS im Submikrometerbereich, da ein kleiner Laserstrahl auch wenig Probe abträgt und damit wenige detektierbare Ionen in das MS gelangen. Daher ist die Untersuchung einzelner Zellen mit dem Elementmikroskop häufig ein Kompromiss aus Sensitivität und Laserstrahlgröße.
Neben der Entwicklung neuer Hardware, die Laser- und Scanbedingungen durch schnellere Auswaschzeiten unter einer Sekunde und kleinere Laserstrahldurchmesser (unter 1 µm) verbessert, können bessere Elementmarkierungen die Empfindlichkeit der Messung erhöhen.3


<h2>Bilder von Nanopartikeln in einzelnen Zellen</h2>
Das Elementmikroskop weist bereits Goldnanopartikel ortsaufgelöst nach5,6 sowie natürlich vorkommende Elemente wie Kupfer und Zink in bestimmten Bindegewebszellen, den adhärenten 3T3-Fibroblasten.7 Nanopartikel lagern sich um den Zellkern (Abbildung 2). Zudem bilden sie Aggregate, die im Spektrum sehr hohe Intensitäten (105 cps) ergeben. Eine Kalibrierung ist mit Nanopartikelstandards möglich. Wie dieses Beispiel zeigt, sind bei ausreichender Empfindlichkeit, hier durch die Nanopartikel, Submikrometer-Auflösungen erreichbar. In diesem Experiment hatte der Laserstrahl einen Durchmesser von 4 µm und eine Vorschubgeschwindigkeit von 4 µm·s—1. In Kombination mit der hohen Laserrepetitionsrate von 20 Hz lag die Pixelauflösung bei etwa 0,2 µm mal 6 µm. Letzteres ist der Abstand zwischen zwei Linienscans des Lasers.
Diese Art des differenziellen Scannens macht Strukturen darstellbar, die kleiner sind als der Durchmesser des Laserstrahls.5 Nimmt man für eine Zelle einen Kreisdurchmesser von 50 µm an, sind unter den gewählten Bedingungen zirka 1500 Pixel pro Zelle zu detektieren.


<h2>Einzelne Zellen markieren und untersuchen</h2>
Mit einer einfachen Markierungsmethode, der Iodierung von Proteinen mit Kaliumtriiodid,8 steigt die Auflösung des Elementmikroskops auf Zellniveau. Die reaktive Iodspezies entsteht in wässriger Lösung aus Iod und Iodid und bindet an die Aminosäuren Histidin und Tyrosin.
In einer ersten Machbarkeitsstudie wurden fixierte 3T3-Fibroblasten auf Objektträgern iodiert.9 Durch die Markierung ist die Zelle mit dem Elementmikroskop einfach zu lokalisieren. Jedoch ist der Geräteuntergrund für das Isotop 127I sehr hoch (104 cps), sodass der linear dynamische Bereich auf eine Größenordnung beschränkt ist und nach Alternativen gesucht wird.
Eine vielversprechende Alternative ist der Chelatbildner Maleimidmonoamid-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (mDOTA) mit einem Lanthanidion als Zentralion. Die reaktive Maleimidgruppe bindet an freie Thiole, zum Beispiel von Proteinen und Peptiden, und färbt die ganze Zelle für die Visualisierung mit dem Elementmikroskop. Eine Inkubationszeit von 30 Minuten reicht aus, um ein 2-D-Profil mit einer Auflösung im Submikrometerbereich zu erstellen.
Um den Zellkern zu lokalisieren und damit nachzuweisen, dass das Massenspektrometer tatsächlich eine Zelle analysiert, haben sich DNA-Interkalatoren etabliert. Diese komplexieren Iridium oder Rhodium und lagern sich zwischen den Basenpaaren des DNA-Strangs ein.10,11
Mit den aufgeführten einfachen Elementmarkierungen in Kombination mit Immunoassays oder mit Nanopartikelstudien ist die Zelle mit dem Elementmikroskop zu identifizieren, Überlagerung mit vor der Messung aufgenommenen Probenfotos ist nicht mehr erforderlich. Ein Beispiel zeigt Abbildung 3, die im Rahmen einer Toxizitätsstudie zur Aufnahme von Nanopartikeln in Zellen entstanden ist. Nach der Nanopartikelinkubation wurden die auf einem Objektträger fixierten A549-Zellen zunächst mit mDOTA(Terbium) und einem Iridiuminterkalator derivatisiert. Es folgte die Analyse mit dem Elementmikroskop. In Abbildung 3 sind einzelne Zellen (blau) zu erkennen. Die Nanopartikel (grün) rund um die Zellkerne (rot) wurden ausschließlich auf Basis der ermittelten 2-D-Elementintensitätsprofile lokalisiert.11


<h2>Bildgebende Diagnostik mit elementmarkierten Antikörpern</h2>
Ein Durchbruch ist aktuell Giesen et al. gelungen. Sie koppelten eine neue Laserzelle an ein spezielles ICP-TOF-MS (CyTOF, Fluidgm) und erzielten zum ersten Mal eine multiplexfähige Bildgebung mit lanthanidmarkierten Antikörpern und LA-ICP-TOF-MS in subzellulärer Auflösung.12,13
Polymermarker bewirken ausreichende Sensitivität.14 Sie komplexieren zirka 30 isotopenreine Lanthanidionen pro Marker. 32 Antikörper aus humanen Brustkrebsgewebedünnschnitten wurden simultan analysiert, woraus sich Zell-Subpopulationen, Zell-Zell-Interaktionen und Unterschiede zwischen Tumorzellen darstellen lassen. Abbildung 4 zeigt die Überlagerung drei ausgewählter Antikörper mit 1 µm Auflösung. Der Zellkern lässt sich eindeutig durch einen Anti-Histon-H3-Antikörper identifizieren (cyan), der wichtige Brustkrebsmarker HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) ist in der Plasmamembran sichtbar (rot), und Vimentin, als Bestandteil des Zytoskeletts, wird durch einen dysprosiummarkierten Antikörper im Zytoplasma lokalisiert (gelb). Die Ergebnisse wurden mit konventioneller Immunfluoreszenzmikroskopie validiert, es waren keine signifikanten Unterschiede in der Spezifität und Charakterisierung der Antikörper festzustellen. Zudem wurde ausgeschlossen, dass sich die hohe Anzahl unterschiedlicher Antikörper negativ auf die Immunreaktion auswirkt.
Die Entwicklung multiplexfähiger bildgebender Diagnostik wird grundlegende Forschung der Heterogenität von Geweben und Zellen sowie deren Funktion und Interaktion erlauben. Sie ist vermutlich der nächste Schritt in Richtung personalisierter Diagnose und Therapie.


<h2>Ausblick</h2>
Das Elementmikroskop kann die bildgebende Einzelzellanalytik vorantreiben. Diese visualisiert Elementverteilungen in einer Zelle, die Aufnahme von metallhaltigen Medikamenten oder Nanopartikeln. Herausragend ist die Eigenschaft des Multiplexing, damit lassen sich mehr als 30 Biomoleküle mit Hilfe elementmarkierter Antikörper simultan in Gewebedünnschnitten und Zellen analysieren. Bei entsprechender Empfindlichkeit ist es möglich, Strukturen aufzulösen, die kleiner sind als die Zelle.
Jedoch ist die LA-ICP-MS-basierte Bildgebung in dieser Größenordnung sehr zeitintensiv. Die Ablation eines Gewebebereiches von zirka 0,5 mm2 mit einer Spotgröße von 1 µm dauert etwa 3,5 Stunden.13 Daher ist es wichtig, neue LA-Systeme mit höheren Scangeschwindigkeiten zu entwickeln, um den Probendurchsatz zu steigern.
Kurze Auswaschzeiten, kleine Laserstrahlgrößen und erhöhte Repetitionsraten sind technisch möglich. Für Multielement-Messungen müssen auch die Zeiten für die Datenverarbeitung am MS sinken, sodass sie Integrationszeiten im Mikrosekundenbereich erreichen.
Angesichts der Komplexität und Vielfalt biologischer Zellen betrachten wir mit dem Elementmikroskop nur einen kleinen Ausschnitt davon. Deshalb unterstützen die Autorinnen die Idee der multimodalen Spektroskopie. Hier leistet das Elementmikroskop in Kombination mit anderen bildgebenden Spektroskopieverfahren wie Synchrotron-Röntgenfluoreszenzspektroskopie SR-XRF, Nano-Flugzeit-Massenspektrometrie Nano-TOF-MS, oberflächenverstärkte Ramanspektroskopie SERS, matrixassistierte Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie Maldi-MS und weiteren seinen Beitrag zu Erkenntnissen in den Lebenswissenschaften.
Larissa Müller, Jahrgang 1982, studierte an der Universität Münster Diplom-Chemie und erstellte ihre Doktorarbeit am Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften, ISAS, Dortmund. Seit dem Jahr 2010 ist sie an der BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung, Berlin, als Postdoc tätig. Ihr Forschungsschwerpunkt ist die Entwicklung multiplexfähiger Immunoassays für die bildgebende Massenspektrometrie. <a href="mailto:larissa.mueller@bam.de">larissa.mueller@bam.de</a>
Antje Herrmann, Jahrgang 1987, erwarb im Jahr 2012 ihren Bachelor- und 2014 ihren Masterabschluss an der Humboldt-Universität zu Berlin. Derzeit promoviert sie unter der Leitung von Ulrich Panne. Ihr Forschungsinteresse gilt der Charakterisierung elementmarkierter Antikörper.


<h2>QUERGELESEN</h2>
Bei der Analyse mit Laser-Ablations-ICP-MS überträgt ein Laser linienweise Probenmaterial ins Massenspektrometer.
Das Ergebnis sind zweidimensionale Intensitätsprofile, welche die lokale Elementverteilung in einer biologischen Probe wiedergeben. Der Durchmesser des Laserstrahls bestimmt die Ortsauflösung, die bis in die Größenordnung von Zellstrukturen reicht.
Analyten sind entweder natürlich vorkommende Elemente, Nanopartikel oder Markierungselemente, die künstlich in die Zelle eingebracht werden, etwa durch kovalente Bindung an Antikörper, und so Zielproteine anzeigen.



<ul>
<li>
1 

 
E. Bianconi, 
A. Piovesan, 
F. Facchin et al., 
<source>Annals of human biology 
(2013), 
40, 
463–<lpage>71.</lpage>
</li>
<li>
2 

 
R. Trouillon, 
M. K. Passarelli, 
J. Wang et al., 
<source>Anal. Chem. 
(2013), 
85, 
522–<lpage>542.</lpage>
</li>
<li>
3 

 
L. Mueller, 
H. Traub, 
N. Jakubowski et al., 
<source>J. Anal. Bioanal. Chem. 
(2014), 
406, 
6963–<lpage>6977.</lpage>
</li>
<li>
4 

 
C. Giesen, 
L. Waentig, 
U. Panne, 
N. Jakubowski, 
<source>Spectrochim. Acta B 
(2012), 
76, 
27–<lpage>39.</lpage>
</li>
<li>
5 

 
D. Drescher, 
C. Giesen, 
H. Traub et al., 
<source>Anal. Chem. 
(2012), 
84, 
9684–<lpage>9688.</lpage>
</li>
<li>
6 

 
T. Büchner, 
D. Drescher, 
H. Traub et al., 
<source>J. Anal. Bioanal. Chem. 
(2014), 
406, 
7003–<lpage>7014.</lpage>
</li>
<li>
7 

H. Traub, D. Drescher, C. Giesen, et al., “LA-ICP-MS zur Analyse einzelner Zellen”, Poster, Tulln, Österreich, 2012.
</li>
<li>
8 

 
L. Waentig, 
N. Jakubowski, 
H. Hayen, 
P. H. Roos, 
<source>J. Anal. Atom. Spectrom. 
(2011), 
26, 
1610–<lpage>1618.</lpage>
</li>
<li>
9 

 
C. Giesen, 
L. Waentig, 
T. Mairinger et al., 
<source>J. Anal. Atom. Spectrom. 
(2011), 
26, 
2160–<lpage>2165.</lpage>
</li>
<li>
10 

 
O. I. Ornatsky, 
X. Lou, 
M. Nitz et al., 
<source>Anal. Chem. 
(2008), 
80, 
2539–<lpage>2547.</lpage>
</li>
<li>
11 

A. Herrmann, “Entwicklung von elementhaltigen Zellstains für das Imaging einzelner Zellen mittels LA-ICP-MS”, Masterthesis, Humboldt-Universität zu Berlin, 2014.
</li>
<li>
12 

 
H. A. Wang, 
D. Grolimund, 
C. Giesen et al., 
<source>Anal. Chem. 
(2013), 
85, 
10107–<lpage>10116.</lpage>
</li>
<li>
13 

 
C. Giesen, 
H. A. Wang, 
D. Schapiro et al., 
<source>Nature methods 
(2014), 
11, 
417–<lpage>22.</lpage>
</li>
<li>
14 

 
X. D. Lou, 
G. H. Zhang, 
I. Herrera et al., 
<source>Angew. Chem. Int. Ed. 
(2007), 
46, 
6111–<lpage>6114.</lpage>
</li>
</ul>

Einmal Flussspat — immer wieder Polymer

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