Wissenschaft & Forschung

Cyclische Peptide natürlichen Ursprungs dienen seit Jahren als Medikamente. Aber nicht gegen alle Krankheiten hält die Natur Peptide bereit. Neue Methoden erlauben es nun, cyclische Peptide gegen beliebige Zielproteine aus großen kombinatorischen Bibliotheken zu isolieren.
Cyclische Peptide sind Moleküle, deren ursprünglich lineare Aminosäurekette kovalent zu einem oder mehreren Ringen geschlossen ist. Das Molekül cyclisiert entweder über eine Peptidbindung zwischen N- und C-Terminus oder über die Aminosäureseitenketten, etwa durch eine Disulfidbrücke. Die Eigenschaften der cyclischen Peptide prädestinieren sie als Therapeutika: Neben einer hohen Bindungsaffinität für Zielproteine haben sie eine hohe Bindungsspezifität, sind stabil und meist nur wenig toxisch. Außerdem lassen sie sich chemisch einfach synthetisieren.Zu einem wesentlichen Teil basieren diese Eigenschaften auf der Struktur: Die eingeschränkt flexible Konformation reduziert den Entropieverlust während der Bindung an das Zielprotein und führt somit zu einer stärkeren Bindung. Außerdem erhöht die beschränkte Zahl an möglichen Konformationen die Bindungsspezifität für das Zielprotein.Ein weiterer Effekt, der für die therapeutische Nutzung entscheidend ist, ist die proteolytische Stabilität: Sie ist höher als bei linearen Peptiden. Die starre Konformation der cyclischen Peptide behindert das Binden in der katalytischen Tasche der Proteasen und somit den Abbau durch diese.<h2>Wirkstoffe aus der Natur</h2>Viele bioaktive cyclische Peptide natürlichen Ursprungs dienen in ursprünglicher oder modifizierter Form als Therapeutika: etwa die Antibiotika Vancomycin, Daptomycin und Polymyxin B, die Hormone oder die Hormonanaloga Oxytocin, Vasopressin und Ocreotid sowie das Immunsuppressivum Ciclosporin. Ciclosporin, Ocreotid und Daptomycin gehören zu den 200 umsatzstärksten Medikamenten in den USA.1)Das therapeutische Potenzial cyclischer Peptide ist bei weitem nicht ausgeschöpft. Ein Grund dafür ist die beschränkte Verfügbarkeit cyclischer Peptidliganden; die Natur bietet nicht für alle Zielproteine cyclische Peptide. Wissenschaftler fragen sich deshalb, wie man synthetische cyclische Peptidliganden entwerfen könnte. Die Strategien dazu lassen sich grob in zwei Herangehensweisen unterteilen: rationales Design und Fischen bioaktiver Liganden aus großen kombinatorischen Peptidbibliotheken.<h2>Rationales Design</h2>Für viele Zielproteine sind Protein- oder Peptidliganden bekannt, die sich als Vorlage für cyclische Peptidliganden eignen. Bei linearen Peptiden wird die Aminosäuresequenz beibehalten, und die N- und C-Enden der Peptide oder die Seitenketten endständiger Aminosäuren werden verbunden.Bei Proteinen werden die Aminosäuresequenzen, die mit dem Zielprotein interagieren, als Peptidsequenz nachgebildet und mit chemischen Reaktionen cyclisiert. Beispielsweise wurden β-Stränge von Proteinen als Vorlage verwendet und als synthetische Peptide so cyclisiert, dass deren Konformation erhalten blieb.2) Basierend auf dem gleichen Prinzip wurden α-Helices aus Bindungsregionen von Proteinen als Peptide synthetisiert und deren α-helikale Konformation durch chemische Brücken stabilisiert.3) Diese und ähnliche Designstrategien lieferten hochaffine cyclische Peptidliganden, von denen einige in klinischen Studien als Therapeutika getestet werden. Beispiele sind das antibakterielle β-Strang-Peptid POL7080 und das p53-reaktivierende, gestapelte Peptid ALRN-6924.<h2>Aus kombinatorischen Bibliotheken</h2>Eine weitere wichtige Strategie, um Peptidliganden zu entwickeln, basiert darauf, bioaktive Liganden in kombinatorischen Peptidbibliotheken zu identifizieren. Dafür wird eine große Anzahl cyclischer Peptide mit zufälligen Aminosäuresequenzen synthetisiert und anschließend mit Hochdurchsatzmethoden getestet. Eine Methode, cyclische Peptidbibliotheken herzustellen, basiert auf der Split-and-pool-Strategie, bei der mit geringem Aufwand viele verschiedene Peptide synthetisiert werden. Neuere Ausführungen dieser Strategie codieren die cyclischen Peptide mit synthetischer DNA.4) Andere Ansätze nutzen programmierte Pipettierroboter, welche die cyclischen Peptide auf individuellen Feldern einer Oberfläche synthetisieren; anschließend testen sie mit fluoreszenzmarkierten Proteinen, ob sie binden.<h2>Bioaktive Peptide mit In-vitro-Display-Techniken identifizieren</h2>Die kombinatorische Synthese macht theoretisch Peptidbibliotheken mit sehr hoher Diversität zugänglich. Besteht ein cyclisches Peptid aus 6 Aminosäuren, ließen sich mit den 20 natürlichen Aminosäuren theoretisch 206, also 64 Millionen verschiedene Peptide herstellen. Diese Zahl erhöht sich bei einem Peptid aus 9 Aminosäuren auf 512 Milliarden. In der Praxis werden jedoch mit diesen Methoden meist weniger als eine Million verschiedener cyclischer Peptide hergestellt und getestet.Die Phage-Display-Methode (Kasten S. 14) ermöglicht, Peptidliganden aus sehr großen Peptidbibliotheken zu identifizieren.5) Bei Phage-Display werden künstliche Peptide oder Proteine auf der Oberfläche von Bakteriophagen verankert. Die Peptid- oder Protein-DNA ist im Bakteriophagengenom integriert und wird dadurch im Phagenpartikel verpackt. Mit der Methode lassen sich Milliarden verschiedener Peptide oder Proteine genetisch codieren. Peptide oder Proteine, die an ein immobilisiertes Zielprotein binden, werden anschließend aus der Bibliothek geangelt und durch DNA-Sequenzierung identifiziert.Um cyclische Peptidliganden mit Phage-Display zu entwickeln, werden die codierten Peptide mit zwei Cysteinen flankiert, die auf den Phagen eine Disulfidbrücke bilden und dadurch cyclisieren (Abbildung 1A, S. 11).6) Neben Phage-Display gibt es viele andere Methoden, um Peptide oder Proteine an deren codierende DNA zu koppeln. Dazu gehören mRNA-Display, Ribosom-Display, Hefen-Display und Bakterien-Display. Wissenschaftler nutzen neben Phage-Display insbesondere mRNA-Display für die In-vitro-Evolution cyclischer Peptidliganden.7) Bei dieser Methode knüpfen Peptide oder Proteine während des Translationsprozesses kovalent an die codierende mRNA (Abbildung 1B).<figure><img src="https://media.graphcms.com/gjUnPBjSfqwS7Qx21X5C"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Genetisch codierte cyclische Peptide. A) Ein Peptid mit zwei Cysteinen ist auf einem Phagen verankert und wird durch Oxidation cyclisiert. B) Ein Peptid ist via Puromycin (Pu) an mRNA gekoppelt und wird durch Reaktion einer unnatürlichen Aminosäure mit Cystein cyclisiert.</figcaption></figure>
<h2>Wie funktioniert Phage-Display?</h2>Bei der Phage-Display-Methode werden viele, meist Milliarden verschiedene Peptide oder Proteine mit deren codierender DNA gekoppelt. Dadurch ergibt sich eine große, genetisch codierte Substanzbibliothek. Peptide oder Proteine, die anschließend an ein Zielprotein binden, werden über die Affinität aus der Bibliothek isoliert („gefischt“, Abbildung A). Der DNA-Code erlaubt, anschließend die Aminosäuresequenz durch DNA-Sequenzierung zu bestimmen. Die Kopplung von Peptid (oder Protein) und DNA gelingt, indem deren DNA in das Genom eines Bakteriophagen an das Gen eines Phagen-Mantelproteins angefügt wird, zum Beispiel dem p3 (Abbildung B).5) Gelangt die veränderte Phagen-DNA in Bakterien, produzieren die Phagen Peptid-p3-Fusionsproteine, die sich zur Herstellung neuer Phagen eignen. Dadurch wird das Peptid auf der Oberfläche der Phagen verankert, während die codierende DNA zusammen mit dem Phagen-Genom im Phagen verpackt wird. Mit dieser Methode wurden peptid- und proteinbasierende Liganden sowie Antikörper hergestellt. Mehrere durch Phage-Display hergestellte humane Antikörper wie der TNFa-Blocker Adalimumab sind äußerst erfolgreiche Medikamente.12)<h2>Mit unnatürlichen Aminosäuren</h2>Bei den vorgestellten In-vitro-Display-Methoden synthetisieren Ribosomen die von DNA oder mRNA codierten kombinatorischen Peptidbibliotheken. Da Ribosomen natürlicherweise Aminosäuren als Bausteine verwenden, sind alle aus diesen Methoden hervorgehenden Liganden Peptide oder Proteine. Verschiedene Strategien erweitern die chemische Diversität der Bibliotheken. Eine besteht darin, genetisch codierte Peptide oder Proteine in chemischen oder enzymatischen Reaktionen zu modifizieren.8)Andere Strategien basieren auf unnatürlichen Aminosäuren: Ribosomen können diese verarbeiten, wenn sie sich strukturell nicht zu stark von den natürlichen Aminosäuren unterscheiden. mRNA-Display hat sich dabei besonders bewährt, da hierbei die Synthese in vitro in einem Zellextrakt abläuft, dem sich vorgefertigte Aminosäure-tRNA-Konjugate leicht zusetzen lassen.9) Auch N-methylierte Aminosäuren lassen sich in mRNA-Display-Bibliotheken einbauen. Zur Cyclisierung mRNA-codierter Peptide wird neben den beschriebenen Strategien eine unnatürliche Aminosäure verwendet, das Na-(2-chloracetyl)-tryptophan. Hierbei reagiert die Chloracetylgruppe mit einer Cysteinseitenkette zu einer Thioetherbrücke (Abbildung 1B).<h2>Bicyclische Peptide</h2>Damit sie sich als Therapeutika eignen, sollten cyclische Peptide idealerweise mit einer pikomolaren Dissoziationskonstante binden. Viele Peptide, die mit Phage-Display und anderen Displaytechniken entwickelt wurden, haben jedoch keine solch hohe Bindungsaffinität.Mit dem Ziel, hochaffine Peptidliganden herzustellen, haben wir eine Strategie entworfen, mit der sich bicyclische Peptide in vitro entwickeln lassen. Die bicyclischen Peptide bestehen aus zwei makrocyclischen Peptidringen (Abbildung 2, S. 13), die gleichzeitig an ein Zielprotein binden. Dadurch erhöhen sich die Bindungsaffinitäten.<figure><img src="https://media.graphcms.com/1MWcuRa4QeO0BuSrMBQf"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Bicyclische Peptide. A) Chemische Struktur, B) dreidimensionales Strukturmodell.</figcaption></figure>
Bicyclische Peptide haben im Vergleich mit monocyclischen Peptiden ähnlicher Größe eine starrere Konformation, was sich positiv auf die proteolytische Stabilität auswirkt. Auch bicyclische Peptide lassen sich in vitro mit Phage-Display herstellen (Abbildung 3 S. 13): Zunächst werden Milliarden von verschiedenen linearen Peptiden, die jeweils drei Cysteine enthalten, auf Bakteriophagen verankert. Im zweiten Schritt werden die Peptide chemisch cyclisiert. Für diese Reaktion werden Moleküle verwendet, die drei thiolreaktive Gruppen enthalten und dadurch mit den Seitenketten der Cysteine reagieren.10) Im dritten Schritt werden die bicyclischen Peptide mit der gewünschten Spezifität aus der Phagenbibliothek gefischt, und deren Peptidsequenz wird durch DNA-Sequenzierung identifiziert.<figure><img src="https://media.graphcms.com/VN89PfTBQuaNz3nOqLNz"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Phage-Display-Methode zur Herstellung bicyclischer Peptidliganden.</figcaption></figure>
Mit dieser Strategie entstanden diverse bicyclische Peptide als Liganden: sowohl für Proteasen wie Plasmakallikrein, Urokinase, Cathepsin G und Faktor XII als auch für Rezeptoren wie Her2 und Notch1. Alle haben Bindungsaffinitäten im nano- oder pikomolaren Bereich. Bei den Proteasen wurden funktionelle Liganden identifiziert, die im aktiven Zentrum der Proteasen binden und deren Aktivität inhibieren (Abbildung 4).11)<figure><img src="https://media.graphcms.com/OEavjsbRTidfxHtUwbdL"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Kristallstrukturen dreier bicyclischer Peptide, die durch Phage-Display gegen Urokinase isoliert wurden. Die drei Peptide mit verschiedenen Peptidsequenzen (in verschiedenen Farben) und chemischen Linker (rot) binden alle an die katalytische Stelle der Urokinase (grau) und inhibieren deren proteolytische Aktivität.</figcaption></figure>
Eine gemeinsame Eigenschaft der mit Phage-Display entwickelten bicyclischen Peptide ist deren hohe Bindungsspezifität für die Zielproteine. Die meisten der bicyclischen Peptide waren in In-vivo-Studien sehr stabil. Konjugation dieser Peptide an Albuminbinder wie Fettsäuren verhinderte, dass die Niere die Substanz zu schnell aus dem Körper entfernte. So wurde eine lange Exposition erreicht. Erste pharmakologische Studien an Tieren laufen.<h2>Perspektiven</h2>Die neuen Techniken ermöglichen, synthetische Peptidliganden für beinahe jedes beliebige Zielprotein zu entwickeln. Dieser Fortschritt hat der Peptidforschung einen Schub verliehen: Viele Unternehmen, darunter Start-ups und etablierte Pharmafirmen, nutzen diese Methoden. Es ist möglich, dass schon bald erste cyclische Peptide aus der In-vitro-Evolution in der Medizin eingesetzt werden.<h2>Quergelesen</h2>Cyclische Peptide eignen sich aufgrund ihrer guten Bindungseigenschaften, um daraus Medikamente zu entwickeln.Indem die Aminosäuresequenz angepasst wird, können cyclische Peptide mit hoher Affinität und Spezifität an beliebige Zielproteine binden.Methoden wie Phage-Display oder mRNA-Display erlauben, Liganden aus Bibliotheken von Milliarden cyclischer Peptide zu isolieren.Christian Heinis ist Associate Professor an der Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Seine Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Entwicklung von neuen Methoden zur Herstellung von Medikamenten, die auf makrocyclischen Molekülen basieren. <email><a href="mailto:christian.heinis@epfl.ch">christian.heinis@epfl.ch</a></email><div><img src="https://media.graphcms.com/1jztf8fzT2Gc6pViwuPV">

</div>Christina Lamers studierte von 2004 bis 2008 Pharmazie an der Universität Frankfurt am Main und promovierte dort von 2010 bis 2014 in pharmazeutischer Chemie bei Manfred Schubert-Zsilavecz. Seit August 2015 ist sie Postdoc im Labor von Christian Heinis für therapeutische Proteine und Peptide.<div><img src="https://media.graphcms.com/Aq3rxYSwTkyaw1hcIVvg">

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<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 E. Vitaku, E. A. Ilardi, J. T. Njarðarson (2013): Top 200 Pharmaceutical Products by US Retail Sales in 2012.</li><li>
2 J. A. Robinson, S. DeMarco, F. Gombert et al., Drug Discov Today 2008, 13, 944.</li><li>
3 P. M. Cromm, J. Spiegel, T. N. Grossmann, ACS Chem. Biol. 2015, 10, 1362.</li><li>
4 Z. J. Gartner, B. N. Tse, R. Grubina et al., Science 2004, 305, 1601.</li><li>
5 G. P. Smith, Science 1985, 228, 1315.</li><li>
6 S. Chen, C. Heinis (2013): Phage selection of mono- and bicyclic peptide ligands in Biotherapeutics – Recent developments using chemical and molecular biology (Hrsg. L. H. Jones, A. J. McKnight), RSC.</li><li>
7 R. W. Roberts, J. W. Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997, 94, 12297.</li><li>
8 C. Heinis, G. Winter, Curr. Opin. Chem. Biol. 2015, 26, 89.</li><li>
9 C. J. Hipolito, H. Suga, Curr. Opin. Chem. Biol. 2012, 16, 196.</li><li>
10 S. Y. Chen, D. Bertoldo, A. Angelini et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 1602.</li><li>
11 A. Angelini, L. Cendron, S. Y. Chen et al., ACS Chem. Biol. 2012, 7, 817.</li><li>
12 A. E. Nixon, D. J. Sexton, R.C. Ladner, Mabs-Austin 2014, 6, 73.</li></ul>

Artikel

Biochemie: Peptide mit hoher Bindungsaffinität

Cyclische Peptide natürlichen Ursprungs dienen seit Jahren als Medikamente. Aber nicht gegen alle Krankheiten hält die Natur Peptide bereit. Neue Methoden erlauben es nun, cyclische Peptide gegen beliebige Zielproteine aus großen kombinatorischen Bibliotheken zu isolieren. Cyclische Peptide sind...

Pigmente aus Algen und Bakterien, zum Beispiel Chlorophyll, tragen dazu bei, den Sauerstoffgehalt sowie den Kohlenstoff- und den Stickstoffkreislauf in Seen und Ozeanen besser zu verstehen.
Die wichtigsten und häufigsten farbgebenden organischen Verbindungen in der Natur sind Chlorophylle in Phytoplankton und Pflanzen.1) Diese Pigmente absorbieren Licht bestimmter Wellenlängen für die Photosynthese und bilden dadurch die Grundlage für das Leben auf der Erde, wie wir es kennen.1)Pigmente und deren Abbauprodukte finden sich überall: in Böden, Gewässern, Sedimenten, Gesteinen und Erdöl (Abbildung 1).2,3) Pigmente aus Gewässern eignen sich dazu, Mikrobiengemeinschaften zu rekonstruieren.3) Außerdem geben Kohlenstoff und Stickstoff, die in den Pigmenten gebunden sind, Aufschluss über Quellen, Umwandlungsprozesse und Entfernung von C- und N-Verbindungen aus der Wassersäule, der Atmosphäre und umliegenden Böden.4)<figure><img src="https://media.graphcms.com/yJu2nezThiQ1fpW4wSwd"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Pigmente in der Natur; großes Foto oben: Algen und Landpflanzen im und um den Rotsee (bei Luzern, Schweiz); Mitte: grüne Pigmente in Bäumen; rechts: Dünnschichtchromatographie von Pigmenten eines Sedimentextrakts aus dem Rotsee. <named-content>Fotos: Sebastian Näher</named-content></figcaption></figure>
Nährstoffe bestimmen die Entwicklung der Mikrobiengemeinschaften in Seen und Ozeanen. Diese Gemeinschaften verändern sich, wenn zum Beispiel Landwirte mehr Düngemittel ausbringen oder ungeklärte Abwässer in die Seen gelangen. Denn dies beeinflusst den Stickstoffkreislauf und verursacht Eutrophierung in den Gewässern. Dieser Prozess geht typischerweise mit einer Massenentwicklung von Algen und mit Sauerstoffarmut einher sowie mit Massensterben von Wasserlebewesen.5) Außerdem sind die Produktion und der Abbau der Biomasse phototropher Organismen wesentliche Bestandteile des Kohlenstoffkreislaufs. Damit sind Pigmente wertvolle Indikatoren für Umwelt- und Klimaveränderungen.Um mehr über die Veränderungen von Mikrobiengemeinschaften zu erfahren und wie Algen und Bakterien den Sauerstoffgehalt des Wassers sowie die Kohlenstoff- und Stickstoffkreisläufe beeinflussen, haben wir die Pigmente in Sedimenten aus Gewässern untersucht.6,7)<h2>Studienobjekte und Mikrobiengemeinschaften</h2>Wir haben drei Schweizer Seen untersucht – den Rotsee, den Zürichsee und den Cadagnosee – sowie das Schwarze Meer (Rumänisches Schelf).6,7)Der Rotsee in der Nähe von Luzern ist mit einer Fläche von 0,46 km2 nur 16 m tief (Abbildung 1). Fast das ganze Jahr bleibt der See geschichtet (stabiler thermischer Gradient mit kälterem Tiefen- und aufgewärmtem Oberflächenwasser), das Tiefenwasser ist sauerstofffrei und schwefelwasserstoffreich. Unter diesen Bedingungen kommen spezielle grüne Schwefelbakterien (Chlorobiaceae) und Schwefelpurpurbakterien (Chromatiaceae) vor, die mit Licht und H2S anoxygene Photosynthese betreiben. Diese Schwefelbakterien findet man auch im alpinen Cadagnosee (0,26 km2 groß, 21 m tief) im Tessin.Während den Rotsee außerdem die Artenvielfalt an Algen und Cyanobakterien prägt, kommen im Cadagnosee vor allem Grünalgen, Diatomeen und Flagellaten vor.Anders ist der Zürichsee (67,3 km2 groß; 137 m tief): Er durchmischt sich generell ein bis zwei Mal jährlich und hat einen höheren Sauerstoffgehalt als die anderen Seen.8,9) In diesem See ist das Cyanobacterium Planktothrix rubescens (Burgunderblutalge) vor allem in den letzten Jahren dominierend geworden und bildet zeitweise sogar mehr als 50 Prozent der gesamten Biomasse.10)Das Schwarze Meer ist ein permanent geschichtetes, brackisches Inlandmeer und das größte Becken der Welt, das durch sauerstofffreies Tiefenwasser geprägt ist (0,46 Millionen km2 groß, 2220 m tief). Auf dem Rumänischen Schelf kommen vor allem Diatomeen, Dinoflagellaten, Cyanobakterien und grüne Schwefelbakterien vor.6)<h2>Analyse der Pigmente in Sedimenten</h2>Pigmente löst man mit organischen Lösungsmitteln aus Sedimenten und isoliert diese mit Hochleistungsflüssigchromatographie (Abbildung 2). Abbildung 1 rechts zeigt den Trennprozess auf einer Silicagel-Platte (Dünnschichtchromatographie) statt einer chromatographischen Säule. Die C- und N-Isotopenzusammensetzung der isolierten Pigmente wird dann an Isotopen-Massenspektrometern gemessen. Dies ist erst seit wenigen Jahren möglich, seitdem leistungsfähige und hochsensitive Instrumente auf dem Markt sind.4)<figure><img src="https://media.graphcms.com/CGFXc9fLRyKrXZVoxj3i"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Links und oben: zweidimensionaler Gaschromatograph mit Flugzeitmassenspektrometer (GC×GC-ToF-MS) beziehungsweise Hochleistungsflüssigchromatograph zur Messung von Pigmenten und Abbauprodukten; rechts Mitte und unten: Pigmente isoliert mit HPLC. <named-content>Quellen: Sebastian Näher, Leco (links)</named-content></figcaption></figure>
Maleimide sind monopyrrolische Abbauprodukte von Pigmenten, die aus jeweils einem der vier Pyrrolringe von Chloropigmenten durch Oxidation entstehen (Abbildung 3, S. 18). Diese Maleimide werden mit Gaschromatographen nach nasschemischer Aufreinigung gemessen.2)<figure><img src="https://media.graphcms.com/ZmV9XvMSnSOSL6CFGXIa"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Strukturen von Chlorophyllen, Bakteriochlorophyllen und deren Abbauprodukten( Pheopigmente, Maleimide).</figcaption></figure>
Die Analyten werden gereinigt, indem die Maleimide von anderen Komponenten im Gesamtextrakt getrennt werden und zwar mit organischen Lösungsmitteln über eine bis zwei Kieselgelsäulen und eine Dünnschichtplatte.2)Eine neue Methode basiert auf zweidimensionaler Gaschromatographie gekoppelt mit einem Flugzeitmassenspektrometer (GC×GC-ToF-MS; Abbildung 2). Damit lassen sich Maleimide in komplexen Mischungen schnell und empfindlich bestimmen. Dazu wird entweder der Gesamtlösungsmittelextrakt injiziert oder die Fraktion, die ein Trennschritt mit einer Kieselgelsäule liefert.11)<h2>Algen- und Bakteriengemeinschaften und Sauerstoff</h2>Die wichtigsten Gruppen phototropher Organismen lassen sich anhand der Pigmente unterscheiden.3) Während Chlorophyll a und seine Abbauprodukte von Algen und Cyanobakterien stammen, sind Bakteriochlorophylle und deren Derivate die Produkte von grünen Schwefel- und Schwefelpurpurbakterien (Abbildung 3).3,6) Da letztere nur unter schwefelwasserstoffreichen Bedingungen vorkommen, zeigen die Pigmente Sauerstoffarmut an.2,6,12) Eine wichtige Anwendung von Pigmenten ist daher, die relativen Sauerstoffgehalte in heutigen Systemen sowie in der Erdgeschichte zu rekonstruieren.2,6,12)Sowohl das Verhältnis von Bakteriochlorophyllen c, d oder e zu Chlorophyll a als auch das Verhältnis der Abbauprodukte 2-Methyl-3-iso-butyl-maleimid (Me, i-Bu) zu 2-Methyl-3-ethyl-maleimid (Me, Et) (Abbildung 3) sind robuste Indikatoren für den Grad von Sauerstoffarmut.12) Zum Beispiel beweisen diese Abbauprodukte, dass zumindest drei der insgesamt fünf großen Massensterbeereignisse der letzten 500 Millionen Jahre, Frasnium-Framenium (Devon), Perm-Tiras-Grenze und Trias-Jura-Grenze, mit Sauerstoffarmut einhergingen und für das Aussterben vieler Arten zumindest mitverantwortlich waren.12) Bei diesen Massensterbeereignissen sind jeweils mindestens 75 Prozent aller Spezies auf der Erde ausgestorben, im größten von ihnen zirka 96 Prozent (Perm-Trias-Grenze, vor etwa 250 Millionen Jahren).13)<h2>Isotope als Indikatoren biogeochemischer Prozesse</h2>Veränderungen von Isotopenverhältnissen erlauben Rückschlüsse auf Umweltveränderungen. Die Fraktionierung wird in der delta(δ)-Notation ausgedrückt, δ13C- und δ15N-Werte als Abweichung des Verhältnisses von 13C zu 12C und 15N zu 14N in der Probe gegenüber einem Standard (C: Vienna Pee Dee Belemnite, VPDB; N: Luftstickstoff, AIR). Aufgrund der sehr geringen Abweichungen (Faktor 1000) werden δ-Werte in Promille (‰) angegeben.In Pigmenten geben Isotope Aufschluss über Quellen, Umwandlungsprozesse und Entfernung von C und N aus Atmosphäre und umliegenden Böden sowie über die langfristige Einlagerung von C und N in Sedimenten.4) Damit haben die phototrophen Mikrobiengemeinschaften in Seen und Ozeanen entscheidenden Einfluss auf den Nährstoffkreislauf und das Klima.Generell zeigen Pflanzenpigmente in Böden niedrigere δ13C-Werte (zirka –32 ‰) als Phytoplankton (zirka –25 ‰) (Abbildung 4a).6) Gerade in den untersuchten Seen wird das organische Material mehrfach umgewandelt, dies ist der Grund für die niedrigen δ13C-Werte, auch wenn das organische Material vor allem im See entsteht (Abbildung 4).6)<figure><img src="https://media.graphcms.com/J6RuTpzLTF2UZZSATpJ0"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Zusammenfassung von C- (oben) und N- (unten) Isotopenergebnissen der Pigmente aus den untersuchten Seen und dem Schwarzen Meer.6) Die Balken repräsentieren die Bandbreite der Werte verschiedener Pigmente von Algen und Cyanobakterien (orange), grünen (grün) und Schwefelpurpurbakterien (violett). OM: organisches Material. (VPDB: Standard, Vienna Pee Dee Belemnite, AIR: Standard, Luftstickstoff)</figcaption></figure>
Pigmente sind labil, und Abbauprozesse sind schneller als der Transport von organischem Material aus Böden in Seen. Daher stammt Chlorophyll aus Seesedimenten vor allem direkt aus dem See. Es werden dann insbesondere Pheopigmente (Abbildung 3) eingeschwemmt, während das intakte Chlorophyll a vor allem vom Phytoplankton im See produziert wird und daher auch andere Isotopensignale aufweisen kann. Zum Bespiel ist im letzten Jahrzehnt durch den Rückgang der Algenproduktivität im Zürichsee der relative Eintrag von organischem Material aus dem Boden angestiegen.7) Radiokohlenstoffdatierungen des organischen Materials im Oberflächensediment zeigen erhöhte Alter durch den Eintrag sehr alten Bodenmaterials (bis zu 20 %) im sehr jungen (rezenten) Seesediment.7)Außerdem verschieben sich die Isotopenverhältnisse durch die Massenentfaltung des Phytoplanktons (Algenblüten). Algenblüten sind durch verschiedene Spezies zu unterschiedlichen Zeiten geprägt, wodurch sich die Kohlenstoffquellen verändern. Gerade zu Zeiten höherer Produktivität kann mehr Kohlenstoff im See gebunden werden und langfristig gespeichert werden, was zu höheren δ13C-Werten führt.Im Gegensatz dazu erlauben die N-Isotopenwerte der Pigmente, die Stickstoffquellen der Organismen (Abbildung 4b) zu rekonstruieren.4) Die hohen δ15N-Werte der Pigmente im Zürichsee lassen sich auf die Dominanz von P. rubescens zurückführen, ein Cyanobakterium, das Nitrat aufnimmt.6,7) Die Verhältnisse sind im Rotsee und im Cadagnosee anders. In beiden Seen wird insbesondere reichlich vorhandenes Ammonium aufgenommen, wodurch sich deutlich niedrigere δ15N-Werte von bis zu –8 ‰ einstellen.6)Einen weiteren Prozess, die Fixierung von Luftstickstoff, betreiben nur spezielle Cyanobakterien, die in diesen Systemen nur eine untergeordnete Rolle spielen. Allerdings sind auf dem Schelf des Schwarzen Meeres Nitrat und Stickstofffixierung die dominierenden Stickstoffquellen, und vor allem die Stickstofffixierung ist verantwortlich für eine Fraktionierung von bis zu 10 ‰ (Abbildung 4).Phototrophe Schwefelbakterien leben dagegen unter Bedingungen der Sprungschicht (Übergang zwischen Oberflächen- und Tiefenwasser mit starkem Temperaturgradienten) oder des Tiefenwassers und haben dadurch andere Signaturen. Die grünen Schwefelbakterien fixieren Kohlenstoff durch den reduktiven Tricarbonsäurezyklus, wodurch deren Bakteriochlorophylle an 13C relativ zur C-Quelle angereichert sind, während Schwefelpurpurbakterien durch den Calvinzyklus 13C abreichern (Abbildung 4).6)Im Fall der niedrigen δ15N-Werte der grünen Schwefelbakterien (Abbildung 4) bedeutet dies, dass diese vor allem Ammonium binden,6) obwohl zumindest von den Spezies im Cadagnosee bekannt ist, dass sie Stickstoff fixieren können.Die Bakteriochlorophyll-a-Synthese ist bei Purpur-Schwefelbakterien fast unabhängig vom Substrat.15) Somit ist es nicht möglich, deren Stickstoffquelle anhand der Pigmente zu bestimmen. Allerdings nehmen auch diese Bakterien vermutlich vor allem das reichlich vorhandene Ammonium in der Sprungschicht und dem Tiefenwasser im Rotsee und Cadagnosee auf.<h2>Veränderungen aus der Vergangenheit</h2>Im Zürichsee zeigen die C-Isotopensignaturen der Pigmente die Abfolge von zunehmender Eutrophierung seit Mitte des 19. Jahrhunderts bis zum Maximum in den 1970er Jahren. Danach sank die Menge an Nährstoffen, da die Einträge aus der Landwirtschaft abnahmen und Abwässer seitdem geklärt werden.7)Da das toxische Cyanobakterium P. rubescens den Hauptteil der Biomasse im See ausmacht, lässt sich dessen Geschichte im See anhand des N-Isotopensignals von Chlorophyll a grob rekonstruieren.7) Seit Ende des letzten Jahrhunderts nimmt der δ15N-Wert zu, da dieses Bakterium zunehmend Algen verdrängt, die neben Nitrat vor allem Ammonium aufnehmen. Nur zur Zeit der maximalen Eutrophierung geht die Biomasse von P. rubescens stark zurück, und andere Cyanobakterien und Algen bestimmen die δ15N-Signatur mit geringeren Werten. Die starke Verschiebung zu niedrigen δ15N-Werten ist Ergebnis des begrenzten Stickstoffangebots in der heutigen, nährstoffarmen Periode.7)In den letzten Jahren wurde P. rubescens zur dominanten Spezies im Zürichsee. Aufrund der Klimaerwärmung ist die Oberflächentemperatur des Sees gestiegen, und der See mischt sich dadurch weniger. Zudem haben die Phosphatkonzentrationen viel stärker abgenommen als die von Nitrat.10) Diese Faktoren haben wohl zu idealen Lebensbedingungen für dieses Cyanobakterium geführt.<h2>Umweltveränderungen rekonstruieren – Fazit</h2>Nicht nur für Biogeochemiker, sondern auch für Wissenschaftler, die sich für den Einfluss von Umwelt- und Klimaveränderungen auf Seen und Ozeane interessieren, eignen sich Chlorophylle und deren Umwandlungsprodukte als Untersuchungsobjekte.Die Mikrobiengemeinschaften in der oberen Wassersäule beeinflussen den Kohlenstoff- und den Stickstoffkreislauf und damit die Wirkung veränderter Nährstoffeinträge. Sie haben Einfluss, wie viel Kohlenstoff Seen und Ozeane aufnehmen und speichern und spielen damit eine Rolle beim Klimawandel.Seit mit dem Haber-Bosch-Verfahren Ammoniak und damit synthetische Düngemittel produziert werden, hat sich der Nitrateintrag in die Umwelt erhöht und zerstört sie zunehmend. Da Nitrat und Ammonium nicht in geologischen Archiven erhalten bleiben, sind die N-Isotope in Pigmenten wertvolle Indikatoren, um die Geschichte des Stickstoffkreislaufs auf der Erde zu rekonstruieren.<h2>Quergelesen</h2>Anhand von Chlorophyllen und ihren Abbauprodukten – Pheopigmenten und Maleimiden – lassen sich Photosynthese betreibende (phototrophe) Mikrobengemeinschaften in Seen und Ozeanen und in früheren Ökosystemen der Erdgeschichte rekonstruieren.Isotopensignaturen der Pigmente liefern einen Einblick in Kohlenstoff- und Stickstoffkreisläufe dieser Systeme, die sich mit den Umweltbedingungen verändern.Daher sind Pigmente wichtige Indikatoren für den Sauerstoffgehalt sowie die Aufnahme und Speicherung von Kohlenstoff und Stickstoff in Gewässern.Sebastian Näher, Jahrgang 1984, hat Geologie an der Universität Mainz und der ETH Zürich studiert und an der ETH Zürich und am Wasserforschungszentrum Eawag, Dübendorf, in Biogeochemie promoviert. Nach Forschungsaufenthalten an der Curtin University in Perth, Australien, und am Zentrum für Marine Umweltwissenschaften (Marum) der Universität Bremen arbeitet er nun bei GNS Science in Neuseeland. Während seiner Zeit in Perth ist unter anderem die vorgestellte Arbeit entstanden. Möglich wurde sie vor allem durch einen zweimonatigen Forschungsaufenthalt am Jamstec (Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology). <a href="mailto:s.naeher@gns.cri.nz">s.naeher@gns.cri.nz</a> Naohiko Ohkouchi, Jahrgang 1966, hat 1995 an der Universität Tokio promoviert. Er arbeitete an den Universitäten Kyoto und Hokkaido sowie an der Woods Hole Oceanographic Institution in den USA, bevor er im Jahr 2002 zu Jamstec wechselte. Dort ist er derzeit Direktor des Departments für Biogeochemie. Zudem ist er Visiting Professor am Department for Environmental Chemistry and Engineering am Tokyo Institute of Technology.<div><img src="https://media.graphcms.com/mVpw9BGHRlugmrxW3aXa">

</div><div><img src="https://media.graphcms.com/joIgZlzGTlnJlGcyRtB0">

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<ul><h2>Literatur</h2><li>
1 H. Scheer, An overview of chlorophylls and bacteriochlorophylls [Hrsg.: B. Grimm et al.], Chlorophylls and Bacteriochlorophylls – Biochemistry, Biophysics, Functions and Applications, Springer, 2006, 1–26.</li><li>
2 S. Naeher, P. Schaeffer, P. Adam, C. J. Schubert, Geochim. Cosmochim. Acta 2013, 119, 248–263.</li><li>
3 B. J. Keely, Geochemistry of chlorophylls [Hrsg.: B. Grimm et al.], Chlorophylls and Bacteriochlorophylls – Biochemistry, Biophysics, Functions and Applications, Springer, 2006, 535– 561.</li><li>
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5 J. Friedrich, F. Janssen, D. Aleynik, Biogeosciences 2014, 11, 1215– 1259.</li><li>
6 S. Naeher, H. Suga, N. O. Ogawa et al., Chem. Geol. 2016, 443, 198–209.</li><li>
7 S. Naeher, H. Suga, N. O. Ogawa et al., Chem. Geol., 2016, 443, 210–219.</li><li>
8 S. Naeher, A. Gilli, R. P. North, Y. Hamann, C. J. Schubert, Chem. Geol. 2013, 352, 125–133.</li><li>
9 S. Näher, A. Gilli, Y. Hamann, C. J. Schubert, Nachr. Chem., 2014, 62, 1094–1097.</li><li>
10 T. Posch, O. Köster, M. M. Salcher, J. H. Pernthaler,. Nature Clim. Change, 2012, 2, 809–813.</li><li>
11 S. Naeher S. K. Lengger, K. Grice, J. Chromatogr., 2016, 1435, 125–135.</li><li>
12 S. Naeher, K. Grice, Chem. Geol. 2015, 404, 100–109.</li><li>
13 A. D. Barnosky N. Matzke, S. Tomiya et al. Nature 2011, 471, 51–57.</li><li>
14 H. Halm, N. Musat, P. Ram et al. Environ. Microbiol. 2009, 11, 1945–1958.</li><li>
15 V. I. Beaumont, L. L. Jahnke, D. J. Des Marais, Org. Geochem. 2000, 31, 1075–1085.</li></ul>

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