Blickpunkt

Im Fokus der Lebenswissenschaften steht der Mensch, der aus Billionen verschiedener Zellen mit unterschiedlichen Aufgaben besteht.1 Lebenswissenschaftler untersuchen Zellpopulationen überwiegend als Lysate, also als eine Menge. Das Ergebnis ist ein Mittelwert, der nicht die ganze Geschichte erzählt. Er lässt uns vielleicht die eine mutierte Zelle übersehen, die für die Entstehung einer Krankheit verantwortlich ist.
Um Unterschiede zwischen Zellen sichtbar zu machen und die Rolle einzelner Zellen zu verstehen, ist es notwendig, diese individuell zu analysieren. Dies erfordert eine robuste, multiplexfähige wie auch eine quantitative Analytik. Vielversprechende Techniken für dieses Forschungsfeld sind beispielsweise Fluoreszenzmikroskopie, Massenspektrometrie, bildgebende Massenspektrometrie und mikrofluidische Chips.
Neu ist ein qualitatives und quantitatives Elementmikroskop auf Basis der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma und Laserablation als Probeneintragssystem (LA-ICP-MS).2,3 Die Idee für die Entwicklung des Elementmikroskops kommt aus der Auswertung von MS-Fingerabdrücken. Zudem ist das ICP-MS ein Multielementdetektor, der viele Elemente des Periodensystems gleichzeitig bestimmt. Weitere Vorteile der Technik liegen in der hohen Genauigkeit, dem weiten linearen Messbereich sowie in den besonders niedrigen Nachweisgrenzen.


<h2>Elementmarkierungen</h2>
Bei der Analyse mit LA-ICP-MS trägt ein Laser die Probe linienweise ab und überträgt sie so in das ICP-MS. Aus den im ICP-MS analysierten Linienscans lassen sich dann zweidimensionale Intensitätsprofile erzeugen, welche die lokale Elementverteilung in der biologischen Probe wiedergeben. Dies können zum einem natürlich vorliegende Elemente wie Kupfer und Eisen, aber auch Nanopartikel sein. Zum anderen kann das Elementmarkierung sein, die künstlich eingeführt wurde. Diese dient dem indirekten Nachweis des Zielanalyten (zum Beispiel ein Protein) in der biologischen Probe.
Ein spezieller Fall ist die Entwicklung multiplexfähiger Immunoassays. Hier ist die Markierung kovalent an einen Antikörper gebunden, der wiederum an das Zielprotein (Antigen) nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip spezifisch andockt. Über die Detektion des Elements mit ICP-MS ist so das Zielprotein zu identifizieren (Abbildung 1). Der Multiplex-Immunoassay erlaubt es, viele Antigene durch den gleichzeitigen Einsatz verschieden markierter Antikörper zu analysieren.4
Der Durchmesser des Laserstrahls bestimmt die Ortsauflösung des Elementmikroskops. Gleichzeitig ist dies der Flaschenhals der LA-ICP-MS im Submikrometerbereich, da ein kleiner Laserstrahl auch wenig Probe abträgt und damit wenige detektierbare Ionen in das MS gelangen. Daher ist die Untersuchung einzelner Zellen mit dem Elementmikroskop häufig ein Kompromiss aus Sensitivität und Laserstrahlgröße.
Neben der Entwicklung neuer Hardware, die Laser- und Scanbedingungen durch schnellere Auswaschzeiten unter einer Sekunde und kleinere Laserstrahldurchmesser (unter 1 µm) verbessert, können bessere Elementmarkierungen die Empfindlichkeit der Messung erhöhen.3


<h2>Bilder von Nanopartikeln in einzelnen Zellen</h2>
Das Elementmikroskop weist bereits Goldnanopartikel ortsaufgelöst nach5,6 sowie natürlich vorkommende Elemente wie Kupfer und Zink in bestimmten Bindegewebszellen, den adhärenten 3T3-Fibroblasten.7 Nanopartikel lagern sich um den Zellkern (Abbildung 2). Zudem bilden sie Aggregate, die im Spektrum sehr hohe Intensitäten (105 cps) ergeben. Eine Kalibrierung ist mit Nanopartikelstandards möglich. Wie dieses Beispiel zeigt, sind bei ausreichender Empfindlichkeit, hier durch die Nanopartikel, Submikrometer-Auflösungen erreichbar. In diesem Experiment hatte der Laserstrahl einen Durchmesser von 4 µm und eine Vorschubgeschwindigkeit von 4 µm·s—1. In Kombination mit der hohen Laserrepetitionsrate von 20 Hz lag die Pixelauflösung bei etwa 0,2 µm mal 6 µm. Letzteres ist der Abstand zwischen zwei Linienscans des Lasers.
Diese Art des differenziellen Scannens macht Strukturen darstellbar, die kleiner sind als der Durchmesser des Laserstrahls.5 Nimmt man für eine Zelle einen Kreisdurchmesser von 50 µm an, sind unter den gewählten Bedingungen zirka 1500 Pixel pro Zelle zu detektieren.


<h2>Einzelne Zellen markieren und untersuchen</h2>
Mit einer einfachen Markierungsmethode, der Iodierung von Proteinen mit Kaliumtriiodid,8 steigt die Auflösung des Elementmikroskops auf Zellniveau. Die reaktive Iodspezies entsteht in wässriger Lösung aus Iod und Iodid und bindet an die Aminosäuren Histidin und Tyrosin.
In einer ersten Machbarkeitsstudie wurden fixierte 3T3-Fibroblasten auf Objektträgern iodiert.9 Durch die Markierung ist die Zelle mit dem Elementmikroskop einfach zu lokalisieren. Jedoch ist der Geräteuntergrund für das Isotop 127I sehr hoch (104 cps), sodass der linear dynamische Bereich auf eine Größenordnung beschränkt ist und nach Alternativen gesucht wird.
Eine vielversprechende Alternative ist der Chelatbildner Maleimidmonoamid-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (mDOTA) mit einem Lanthanidion als Zentralion. Die reaktive Maleimidgruppe bindet an freie Thiole, zum Beispiel von Proteinen und Peptiden, und färbt die ganze Zelle für die Visualisierung mit dem Elementmikroskop. Eine Inkubationszeit von 30 Minuten reicht aus, um ein 2-D-Profil mit einer Auflösung im Submikrometerbereich zu erstellen.
Um den Zellkern zu lokalisieren und damit nachzuweisen, dass das Massenspektrometer tatsächlich eine Zelle analysiert, haben sich DNA-Interkalatoren etabliert. Diese komplexieren Iridium oder Rhodium und lagern sich zwischen den Basenpaaren des DNA-Strangs ein.10,11
Mit den aufgeführten einfachen Elementmarkierungen in Kombination mit Immunoassays oder mit Nanopartikelstudien ist die Zelle mit dem Elementmikroskop zu identifizieren, Überlagerung mit vor der Messung aufgenommenen Probenfotos ist nicht mehr erforderlich. Ein Beispiel zeigt Abbildung 3, die im Rahmen einer Toxizitätsstudie zur Aufnahme von Nanopartikeln in Zellen entstanden ist. Nach der Nanopartikelinkubation wurden die auf einem Objektträger fixierten A549-Zellen zunächst mit mDOTA(Terbium) und einem Iridiuminterkalator derivatisiert. Es folgte die Analyse mit dem Elementmikroskop. In Abbildung 3 sind einzelne Zellen (blau) zu erkennen. Die Nanopartikel (grün) rund um die Zellkerne (rot) wurden ausschließlich auf Basis der ermittelten 2-D-Elementintensitätsprofile lokalisiert.11


<h2>Bildgebende Diagnostik mit elementmarkierten Antikörpern</h2>
Ein Durchbruch ist aktuell Giesen et al. gelungen. Sie koppelten eine neue Laserzelle an ein spezielles ICP-TOF-MS (CyTOF, Fluidgm) und erzielten zum ersten Mal eine multiplexfähige Bildgebung mit lanthanidmarkierten Antikörpern und LA-ICP-TOF-MS in subzellulärer Auflösung.12,13
Polymermarker bewirken ausreichende Sensitivität.14 Sie komplexieren zirka 30 isotopenreine Lanthanidionen pro Marker. 32 Antikörper aus humanen Brustkrebsgewebedünnschnitten wurden simultan analysiert, woraus sich Zell-Subpopulationen, Zell-Zell-Interaktionen und Unterschiede zwischen Tumorzellen darstellen lassen. Abbildung 4 zeigt die Überlagerung drei ausgewählter Antikörper mit 1 µm Auflösung. Der Zellkern lässt sich eindeutig durch einen Anti-Histon-H3-Antikörper identifizieren (cyan), der wichtige Brustkrebsmarker HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) ist in der Plasmamembran sichtbar (rot), und Vimentin, als Bestandteil des Zytoskeletts, wird durch einen dysprosiummarkierten Antikörper im Zytoplasma lokalisiert (gelb). Die Ergebnisse wurden mit konventioneller Immunfluoreszenzmikroskopie validiert, es waren keine signifikanten Unterschiede in der Spezifität und Charakterisierung der Antikörper festzustellen. Zudem wurde ausgeschlossen, dass sich die hohe Anzahl unterschiedlicher Antikörper negativ auf die Immunreaktion auswirkt.
Die Entwicklung multiplexfähiger bildgebender Diagnostik wird grundlegende Forschung der Heterogenität von Geweben und Zellen sowie deren Funktion und Interaktion erlauben. Sie ist vermutlich der nächste Schritt in Richtung personalisierter Diagnose und Therapie.


<h2>Ausblick</h2>
Das Elementmikroskop kann die bildgebende Einzelzellanalytik vorantreiben. Diese visualisiert Elementverteilungen in einer Zelle, die Aufnahme von metallhaltigen Medikamenten oder Nanopartikeln. Herausragend ist die Eigenschaft des Multiplexing, damit lassen sich mehr als 30 Biomoleküle mit Hilfe elementmarkierter Antikörper simultan in Gewebedünnschnitten und Zellen analysieren. Bei entsprechender Empfindlichkeit ist es möglich, Strukturen aufzulösen, die kleiner sind als die Zelle.
Jedoch ist die LA-ICP-MS-basierte Bildgebung in dieser Größenordnung sehr zeitintensiv. Die Ablation eines Gewebebereiches von zirka 0,5 mm2 mit einer Spotgröße von 1 µm dauert etwa 3,5 Stunden.13 Daher ist es wichtig, neue LA-Systeme mit höheren Scangeschwindigkeiten zu entwickeln, um den Probendurchsatz zu steigern.
Kurze Auswaschzeiten, kleine Laserstrahlgrößen und erhöhte Repetitionsraten sind technisch möglich. Für Multielement-Messungen müssen auch die Zeiten für die Datenverarbeitung am MS sinken, sodass sie Integrationszeiten im Mikrosekundenbereich erreichen.
Angesichts der Komplexität und Vielfalt biologischer Zellen betrachten wir mit dem Elementmikroskop nur einen kleinen Ausschnitt davon. Deshalb unterstützen die Autorinnen die Idee der multimodalen Spektroskopie. Hier leistet das Elementmikroskop in Kombination mit anderen bildgebenden Spektroskopieverfahren wie Synchrotron-Röntgenfluoreszenzspektroskopie SR-XRF, Nano-Flugzeit-Massenspektrometrie Nano-TOF-MS, oberflächenverstärkte Ramanspektroskopie SERS, matrixassistierte Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie Maldi-MS und weiteren seinen Beitrag zu Erkenntnissen in den Lebenswissenschaften.
Larissa Müller, Jahrgang 1982, studierte an der Universität Münster Diplom-Chemie und erstellte ihre Doktorarbeit am Leibniz-Institut für Analytische Wissenschaften, ISAS, Dortmund. Seit dem Jahr 2010 ist sie an der BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung, Berlin, als Postdoc tätig. Ihr Forschungsschwerpunkt ist die Entwicklung multiplexfähiger Immunoassays für die bildgebende Massenspektrometrie. <a href="mailto:larissa.mueller@bam.de">larissa.mueller@bam.de</a>
Antje Herrmann, Jahrgang 1987, erwarb im Jahr 2012 ihren Bachelor- und 2014 ihren Masterabschluss an der Humboldt-Universität zu Berlin. Derzeit promoviert sie unter der Leitung von Ulrich Panne. Ihr Forschungsinteresse gilt der Charakterisierung elementmarkierter Antikörper.


<h2>QUERGELESEN</h2>
Bei der Analyse mit Laser-Ablations-ICP-MS überträgt ein Laser linienweise Probenmaterial ins Massenspektrometer.
Das Ergebnis sind zweidimensionale Intensitätsprofile, welche die lokale Elementverteilung in einer biologischen Probe wiedergeben. Der Durchmesser des Laserstrahls bestimmt die Ortsauflösung, die bis in die Größenordnung von Zellstrukturen reicht.
Analyten sind entweder natürlich vorkommende Elemente, Nanopartikel oder Markierungselemente, die künstlich in die Zelle eingebracht werden, etwa durch kovalente Bindung an Antikörper, und so Zielproteine anzeigen.



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1 

 
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F. Facchin et al., 
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M. K. Passarelli, 
J. Wang et al., 
<source>Anal. Chem. 
(2013), 
85, 
522–<lpage>542.</lpage>
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3 

 
L. Mueller, 
H. Traub, 
N. Jakubowski et al., 
<source>J. Anal. Bioanal. Chem. 
(2014), 
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6963–<lpage>6977.</lpage>
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4 

 
C. Giesen, 
L. Waentig, 
U. Panne, 
N. Jakubowski, 
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C. Giesen, 
H. Traub et al., 
<source>Anal. Chem. 
(2012), 
84, 
9684–<lpage>9688.</lpage>
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6 

 
T. Büchner, 
D. Drescher, 
H. Traub et al., 
<source>J. Anal. Bioanal. Chem. 
(2014), 
406, 
7003–<lpage>7014.</lpage>
</li>
<li>
7 

H. Traub, D. Drescher, C. Giesen, et al., “LA-ICP-MS zur Analyse einzelner Zellen”, Poster, Tulln, Österreich, 2012.
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8 

 
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N. Jakubowski, 
H. Hayen, 
P. H. Roos, 
<source>J. Anal. Atom. Spectrom. 
(2011), 
26, 
1610–<lpage>1618.</lpage>
</li>
<li>
9 

 
C. Giesen, 
L. Waentig, 
T. Mairinger et al., 
<source>J. Anal. Atom. Spectrom. 
(2011), 
26, 
2160–<lpage>2165.</lpage>
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<li>
10 

 
O. I. Ornatsky, 
X. Lou, 
M. Nitz et al., 
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80, 
2539–<lpage>2547.</lpage>
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<li>
11 

A. Herrmann, “Entwicklung von elementhaltigen Zellstains für das Imaging einzelner Zellen mittels LA-ICP-MS”, Masterthesis, Humboldt-Universität zu Berlin, 2014.
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12 

 
H. A. Wang, 
D. Grolimund, 
C. Giesen et al., 
<source>Anal. Chem. 
(2013), 
85, 
10107–<lpage>10116.</lpage>
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13 

 
C. Giesen, 
H. A. Wang, 
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<source>Nature methods 
(2014), 
11, 
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14 

 
X. D. Lou, 
G. H. Zhang, 
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<source>Angew. Chem. Int. Ed. 
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46, 
6111–<lpage>6114.</lpage>
</li>
</ul>

Artikel

Bilder einzelner Zellen aus dem Elementmikroskop

Im Fokus der Lebenswissenschaften steht der Mensch, der aus Billionen verschiedener Zellen mit unterschiedlichen Aufgaben besteht.1 Lebenswissenschaftler untersuchen Zellpopulationen überwiegend als Lysate, also als eine Menge. Das Ergebnis ist ein Mittelwert, der nicht die ganze Geschichte erzäh...

Das internationale Chemiewaffenübereinkommen1 (CWÜ) untersagt Herstellung, Lagerung und Einsatz von chemischen Waffen sowie den Einsatz toxischer Chemikalien als Waffe. Bis auf Ägypten, Südsudan und Nordkorea haben alle Staaten das Übereinkommen unterzeichnet; in Israel hat das Parlament das Übereinkommen noch nicht bestätigt. Ob sich die Unterzeichnerstaaten daran halten, kontrolliert die Organisation für das Verbot Chemischer Waffen (Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons, OPCW, Kasten). Besonders überwacht die OPCW Substanzen, die in drei Chemikalienlisten aufgeführt sind. In Teil A stehen die giftigen Substanzen selbst, in Teil B die Vorläufer.


<h2>Überwachte Substanzen</h2>
Für die Stoffe der Liste 1 gibt es bis auf eine Ausnahme in der Krebstherapie keine zivile Verwendung. Hier finden sich die Nervenkampfstoffe, Schwefel- und Stickstoffloste sowie die Toxine Saxitoxin und Ricin. Stoffe der Liste 2 werden für erlaubte Zwecke nur in geringen Mengen produziert. Dazu zählen Pinacolylyalkohol (3,3-Dimethyl-2-butanol), ein Ausgangsstoff für den Nervenkampfstoff Soman, sowie sämtliche Phosphorverbindungen, in denen eine Methyl-, Ethyl-, N-Propyl- oder Isopropylgruppe am Phosphor gebunden ist. Stoffe der Liste 3 schließlich werden für erlaubte Zwecke in großen Mengen produziert. Hier finden sich unter anderem Phosgen und Cyanwasserstoff, aber auch der weit verbreitete Kosmetikzusatz Triethanolamin (2,2',2''-Nitrilotriethanol).
Die Schwellenwerte für die Deklaration unterscheiden sich bei den Listen: Bei Stoffen der Liste 3 liegen sie bei 30 t pro Jahr pro Anlage, für Stoffe der Liste 2.B bei 1 t pro Jahr und Anlage und für Stoffe der Liste 1 bei 100 g pro Jahr, wobei für die Stoffe auf Liste 1 erweiterte Regelungen gelten. Über die Listenverbindungen hinaus sind auch andere Produktionsanlagen deklarationspflichtig, etwa solche, die organische Verbindungen herstellen, die Phosphor, Schwefel oder Fluor enthalten und deren Produktionsmenge 30 t im Jahr überschreitet. Weitere Details hierzu finden sich im Verifikationsanhang des Chemiewaffenübereinkommens.1


<h2>Stoffe finden</h2>
Bei vielen Inspektionen vergleichen die Inspektoren der OPCW die Deklarationen mit den Aufzeichnungen vor Ort. Ob die deklarierten oder nicht deklarierten Chemikalien vorhanden sind, ist allerdings nur durch Probennahme und anschließende instrumentelle Analytik zu beweisen.
In der Regel ist die Analytik qualitativ: Eine Chemikalie ist entweder in der Probe vorhanden oder nicht. In der Praxis kann es durchaus schwierig sein, das festzustellen: Eine Vielfalt von möglichen Probenmatrizes — von Abwässern über Wischproben bis hin zum Reaktorinhalt — mit jeder möglichen Art von Verunreinigung trifft auf eine im Prinzip unbegrenzte Anzahl von Listenverbindungen, denn Liste 2.B.04 beispielsweise definiert eine ganze Substanzklasse und damit theoretisch eine unbegrenzte Zahl von Chemikalien. Selbst eine Beschränkung auf die Stoffe der Liste 1 ergibt über eine Million mögliche Verbindungen.
Die Analytik kann auch quantitativ sein, etwa um sicherzustellen, dass die Restkonzentration von Kampfstoffen nach dem Vernichtungsprozess unterhalb der vorgeschriebenen Grenzwerte liegt.


<h2>Industrieinspektionen mit Probennahme und Analytik</h2>
Aktuell führt die OPCW etwa zehn Inspektionen von Liste-2-Anlagen pro Jahr mit Probennahme und Analytik vor Ort durch. Den analytischen Teil übernehmen die Chemiker des Inspektorats. Sie nutzen dazu einen Standard-Gaschromatographen, gekoppelt mit einem Quadrupolmassenspektrometer mit Elektronenstoßionisation (GC-MS(EI)). Das Labor der OPCW wartet diese Geräte und zertifiziert sie für Inspektionsmissionen nach ISO 17025.
Zusätzlich zu dem Spektrometer führt das Inspektionsteam die gesamte Ausrüstung mit, die erforderlich ist, vor Ort ein autarkes Labor aufzubauen. Neben Geräten und Chemikalien zur Probenaufbereitung nimmt das Team bei Bedarf beispielsweise einen transportablen Abzug oder Stromgeneratoren mit. Das Gewicht für die Ausrüstung kann dabei 1 t leicht überschreiten.
Probennahme und Analytik dürfen bei Liste-2-Inspektionen nicht länger als 96 Stunden dauern, denn die Inspektionstätigkeiten sollen den Betriebsablauf so wenig wie möglich stören. Verdachtsinspektionen sind auf 84 Stunden begrenzt, allerdings würde dabei die Analytik nach der Inspektion extern durchgeführt.


<h2>Geheimhaltung durch Software</h2>
Ein Aspekt bei Industrieinspektionen, der bei der Ausarbeitung des Verifikationsanhangs besondere Beachtung fand, ist der Schutz von Geschäftsgeheimnissen der inspizierten Betriebe. Bei der Analytik suchen die Inspektoren daher nur Listenstoffe. Andere Bestandteile beispielsweise eines Reaktorinhalts soll die OPCW-Analytik nicht erfassen. In der Praxis wird dies dadurch erreicht, dass keine Person, sondern die Software Amdis (Automatic Mass Spectral Deconvolution and Identification System) die Daten eines GC-MS-Laufs auswertet.2 Das National Institute for Standards and Technology (NIST) der USA hat Amdis speziell für die OPCW entwickelt. Damit lassen sich auch Zielverbindungen in komplexen Matrizes nachweisen.
Bei Inspektionen greift Amdis ausschließlich auf die analytische Bibliothek der OPCW zurück, die allen Vertragsstaaten zugänglich ist. Diese OPCW Central Analytical Database (OCAD) enthält Massenspektren und Retentionsindizes von über 5000 Listenverbindungen, dazu kommen je um die 1000 NMR- und IR-Spektren. Amdis vergleicht die Daten des jeweiligen GC-MS-Laufs sowohl mit den Massenspektren als auch mit den Retentionsindizes und zeigt als Treffer ausschließlich Listenverbindungen an. Bei Diskrepanzen können auch andere Datenbanken zur Klärung herangezogen werden, etwa die des NIST, sofern der inspizierte Vertragsstaat einverstanden ist.
Am Ende der Inspektion wird die Festplatte mit den Daten durch mehrmaliges Überschreiben gelöscht und nach Rückkehr der Ausrüstung zur OPCW-Zentrale geschreddert.


<h2>Unabhängige Labore</h2>
Sind 5000 Einträge in der Datenbank nicht viel zu wenig, wenn man die Zahl der möglichen Listenverbindungen betrachtet? Nun ist die Zahl der theoretisch möglichen Listenverbindungen nicht gleich der Zahl der praktisch relevanten Listenverbindungen.
Die 5000 Einträge in OCAD enthalten die Daten für alle bisher bevorrateten chemischen Kampfstoffe und ihre Vorläuferstoffe sowie die in der chemischen Industrie relevanten Listenstoffe.
Dennoch ist es notwendig, Stoffe bestimmen zu können, für die keine Datenbankeinträge existieren. Daher sieht das Chemiewaffenübereinkommen die Möglichkeit vor, Proben in von der OPCW zertifizierten externen Laboren analysieren zu lassen, die Labore werden auch als “designiert” bezeichnet. Bisher musste bei einer Industrieinspektion diese “off-site analysis” allerdings noch nicht angewandt werden.
Wenn die OPCW hingegen einer möglichen Vertragsverletzung nachgeht (Verdachtsinspektion oder Untersuchungen bei behauptetem Einsatz, “investigation of alledged use”), wird schon aufgrund der politischen Brisanz diese Form der Probenverarbeitung gewählt — in dem Fall müssen mindestens zwei voneinander unabhängige Labore die Proben untersuchen.
Bevor die OPCW ein externes Labor zertifiziert, muss es drei Voraussetzungen erfüllen. Das Labor muss 
für die Analyse von chemischen Kampfstoffen und ihren Vorläufer- und Abbauprodukten nach ISO 17025 akkreditiert sein,
mindesten einmal im Jahr an einem Ringversuch (Proficiency Test) der OPCW teilnehmen, 
in den letzten drei Ringversuchen entweder jeweils das bestmögliche Ergebnis erzielen (A — alle relevanten Chemikalien wurden gefunden und der Bericht enthält keine Fehler), oder zwei “A” und ein “B” erreicht haben (B — eine Chemikalie wurde nicht gefunden oder der Bericht enthält Fehler, sodass eine Chemikalie nicht gewertet werden kann).
Alle drei Jahre kann sich ein Labor also einen Fehler bei einer einzelnen Chemikalie erlauben. Schlechtere Testergebnisse führen zu einer vorübergehenden Suspendierung des Labors. Es bleibt designiert, erhält aber keine Proben zur Analyse mehr. Die Suspendierung wird aufgehoben, wenn es die Anforderungen wieder erfüllt.
Gibt ein Labor falsch-positive Ergebnisse an, so gilt der Ringversuch als nicht bestanden (Note “F”), und das Labor verliert die Designierung, und zwar so lange, bis es die Anforderungen wieder erfüllt. Das Gleiche passiert, wenn ein Labor die Akkreditierung verliert oder in einem Kalenderjahr nicht an einem Ringversuch teilnimmt.
Aktuell sind 19 Labore aus 15 Mitgliedsstaaten designiert. In Deutschland ist es das Wehrwissenschaftliche Institut für Schutztechnologien — ABC-Schutz (WIS) in Munster.


<h2>Analytische Techniken in den OPCW-Ringversuchen</h2>
Ein Test besteht aus sechs Proben in zwei verschiedenen Matrizes wovon je eine Probe eine Leer- und eine Kontrollprobe ist.3 Die Konzentration der Analyten beträgt mindestens 1 ppm, in Kontrollproben mindestens 5 ppm.
Traditionell sind GC-MS mit Elektronenstoßionisation (EI) und GC-MS mit chemischer Ionisation (CI) die am häufigsten verwendeten Techniken. GC-MS(EI) hat den Vorteil, dass die Ergebnisse mit der OCAD-Datenbank oder kommerziellen Datenbanken wie der vom NIST abgeglichen werden können.
Während die meisten Kampfstoffe nach Probenaufbereitung direkt erfassbar sind, erfordert der Nachweis vieler Vor- und Abbauprodukte eine Derivatisierung. Ergänzt werden die GC-Techniken durch Kopplungen an elementspezifische Detektoren wie Flammenphotometrischer Detektor, FPD, Stickstoff-Phosphor-Detektor, NPD, oder Atomemissionsdetektor, AED.
In den letzten Jahren haben LC-MS- und LC-MS/MS-Techniken deutlich an Bedeutung gewonnen. Dabei geht der Trend zu Geräten, die hochauflösende Massenspektren und damit Hinweise auf die Summenformeln eines unbekannten Analyten liefern, insbesondere Q-TOF-und Orbitrap-Geräte.
Es ist mittlerweile üblich, dass es in einem Ringversuch für ein oder zwei Analyten keinerlei Datenbankeinträge gibt. Einige der Verbindungen, die in den letzten Tests enthalten waren, zeigt Abbildung 1. Die teilnehmenden Labore müssen also die Struktur des Analyten aufklären, um zu entscheiden, ob er im Bericht zu erwähnen ist oder nicht. Neben der hochauflösenden Massenspektrometrie und den elementspezifischen Detektoren hat sich hier die NMR-Spektroskopie als weitere Technik bewährt.
Während in den ersten Ringversuchen noch eindimensionale Experimente wie 31P-NMR mit Standardaddition dominierten, sind es heute inverse 2D-NMR-Experimente wie 1H-31P-HSQC/HMQC und Cosy/Tocsy, die entscheidende Hinweise auf Struktur und Konnektivität liefern.4 Dabei nutzen die Labore NMR-Spektrometer mit 500- oder 600-MHz und Cryoprobenköpfen. Diese Geräte liefern auch bei Analytkonzentrationen bis 1 ppm in akzeptablen Zeiträumen, also innerhalb von ein bis vier Stunden Ergebnisse.
Schließlich muss ein Labor in der Lage sein, Referenzverbindungen mindestens in Mikromengen zu synthetisieren, um die Identität einer Verbindung durch Vergleich mit der Referenz zu beweisen. Ein Ringversuch dauert zwei Wochen einschließlich der Zeit, die das Verfassen des Berichts dauert. Referenzsubstanzen müssen daher oft schnell verfügbar sein. Dies erfordert nicht nur synthetisches Wissen und Geschick, sondern das Labor muss auch eine breite Palette an Synthesebausteinen bereithalten.


<h2>Giftgaseinsatz vermutet — biomedizinische Proben</h2>
 Die bisherigen OPCW-Ringversuche bezogen sich ausschließlich auf Umweltproben. Die OPCW bereitet aktuell Ringversuche für Blut-, Plasma- und Urinproben vor, die zu einer separaten Designierung führen sollen. Zur Vorbereitung wurde in den vergangenen fünf Jahren jeweils ein Test unter Übungsbedingungen durchgeführt. Bei biomedizinischen Proben liegt die besondere Schwierigkeit darin, dass die Analytkonzentrationen deutlich niedriger sind als bei Umweltproben.
Untersucht werden entweder Metabolite, vor allem Hydrolyseprodukte, oder Proteinaddukte, also Butyrylcholinesterase und Serumalbumin bei Nervenkampfstoffen sowie Hämoglobin und Serumalbumin bei Schwefellost.5,6 Die typischen Konzentrationen liegen hierbei im niedrigen ppb- oder sub-ppb-Bereich. GC-MS/MS und LC-MS/MS sind hier die Techniken der Wahl, Multiple Reaction Monitoring (MRM) die dominierende Methode.
Sowohl für Nervenkampfstoffe als auch für Schwefellost wurden sämtliche relevanten Methoden sowohl für Urin- als auch für Plasmaproben getestet, sodass eine große Zahl von Laboren heute diese Analytik durchführen kann. Für die OPCW ist die Fähigkeit, biomedizinische Proben zu analysieren, vor allem im Hinblick auf Untersuchungen bei vermutetem Einsatz wichtig. Der Einsatz von Sarin im syrischen Ghuta im August 2013 und die folgende Untersuchung haben dies erneut deutlich gemacht.


<h2>Proben aus Syrien</h2>
Da Syrien zum Zeitpunkt des Chemiewaffeneinsatzes in Ghuta noch nicht dem Chemiewaffenübereinkommen beigetreten war, lief die Untersuchung des Vorfalls unter dem Mandat der Vereinten Nationen. Die OPCW und die Weltgesundheitsorganisation stellten Personal und Ausrüstung bereit. Das Inspektionsteam vor Ort sammelte sowohl Umweltproben, darunter Bodenproben, Munitionsteile, Stoff- und Faserproben sowie Wischproben als auch Blut- und Urinproben.
Insgesamt vier Labore in Deutschland, Finnland, Schweden und der Schweiz untersuchten sie und fanden Beweise für den Einsatz des Nervenkampfstoffs Sarin: Sie wiesen in den jeweiligen Proben sowohl den Kampfstoff selbst nach als auch Hydrolyseprodukte, charakteristische Nebenprodukte und spezifische Biomarker.7


<h2>Entwicklungsfelder: Toxine und Marker</h2>
Das Chemiewaffenübereinkommen und damit auch seine Verifikationsmechanismen operieren nicht in einem statischen Umfeld.8 Daher gehört die Entwicklung neuer Methoden zu den Aufgaben der OPCW.9 Ein weiteres aktuelles Arbeitsfeld betrifft die Verbesserung der Fähigkeiten, Toxine, insbesondere Proteintoxine zu analysieren; hierzu gibt es ein von der EU gefördertes Projekt der OPCW. Dazu kommt die Analytik von Umweltproben im Spurenbereich (niedriger ppm Bereich). Gesucht wird nach spezifischen chemischen Signaturen und Markern für hochreaktive Chemikalien, die auch noch Wochen oder Monate nach ihrem Einsatz zu identifizieren sind.
Marc Blum hat an der TU Braunschweig Chemie studiert. Nach der Promotion bei Heinrich Rüterjans an der Universität Frankfurt über ein Enzym zum Abbau von Nervenkampfstoffen folgten eine freiberufliche Forschungstätigkeit in München sowie ein Aufenthalt als Director's Fellow am Los Alamos National Laboratory. Seit dem Jahr 2012 ist Blum Senior Analytical Chemist im Labor der OPCW. <a href="mailto:marc.blum@opcw.org">marc.blum@opcw.org</a>


<h2>QUERGELESEN</h2>
Chemiewaffeninspektionen in Industriebetrieben erfordern Probennahme und Analytik vor Ort innerhalb von 96 Stunden, dazu kommen Auf- und Abbau des Labors.
Die Proben sind in der Regel Umweltproben, gesucht sind Spuren im ppm-Bereich. Standardtechnik ist GC-MS mit Elektronenstoß- oder chemischer Ionisation.
Biomedizinische Proben wie Blut oder Urin sind auf Konzentrationen im ppb-Bereich und darunter mit GC-MS/MS oder LC-MS/MS zu untersuchen.
Um Betriebsgeheimnisse zu wahren, wertet bei Industrieinspektionen ein Softwareprogramm die Spektren aus.


<h2>Das Chemiewaffenübereinkommen</h2>
Im Jahr 1997 ist das Chemiewaffenübereinkommen (CWÜ) in Kraft getreten. Dieses internationale Abrüstungsabkommen hat ein umfassendes Regelwerk zur Verifikation. Die Organisation für das Verbot Chemischer Waffen (Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons, OPCW) in Den Haag setzt das CWÜ um und kontrolliert, ob die Vertragsstaaten es einhalten. Die Kontrollen basieren dabei auf den Deklarationen der Vertragsstaaten. Die Staaten geben an, welche Chemiewaffen sie besitzen, also Kampfstoffe und Munition, über welche Vorläufersubstanzen und Produktionseinrichtungen sie verfügen und welche unter Aufsicht von OPCW-Inspektoren vernichtet wurden. Darüber hinaus sind bestimmte Produktionsanlagen in der chemischen Industrie deklarationspflichtig und werden regelmäßig im Rahmen von vertrauensbildenden Industrieinspektionen kontrolliert. Hier sind Inspektionen Routine und finden statt, auch ohne dass eine Vertragsverletzung vermutet wird. Die politischen Organe der OPCW, der Exekutivrat und die Vertragsstaatenkonferenz, können darüber hinaus Maßnahmen wie Verdachtsinspektionen oder Untersuchungen einleiten, wenn der Verdacht einer Vertragsverletzung besteht oder der Einsatz von chemischen Waffen behauptet wird (“investigation of alleged use”).



<ul>
<li>
1 

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(2010), 
82, 
(<issue>15</issue>), 
6593–<lpage>6600</lpage>.
</li>
<li>
6 

 
F. Gandor, 
M. Gawlik, 
H. Thiermann, 
H. John, 
<source>J. Anal. Toxicol., 
(2015), 
39, 
(<issue>4</issue>), 
270–<lpage>279</lpage>.
</li>
<li>
7 

United Nations Mission to Investigate Allegations of the use of Chemical Weapons in the Syrian Arab Republic, Final report, 2013; at <ext-link ext-link-type="uri"><a href="https://unoda-web.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2013/12/report.pdf" target="_blank">unoda-web.s3.amazonaws.com/wp-content/uploads/2013/12/report.pdf</a></ext-link>.
</li>
<li>
8 

 
A. Üzumcü, 
<source>Anal. Bioanal. Chem., 
(2014), 
406, 
(<issue>21</issue>), 
5071–<lpage>5073</lpage>.
</li>
<li>
9 

siehe z. B. Sonderband in Anal. Bional. Chem. 2014, 406(21).
</li>
</ul>

Artikel

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