Blickpunkt

Prof.Dr.


<p>Die Bestimmung des Proteingehalts über den Stickstoffgehalt nach Kjeldahl ist eine der ältesten Methoden in der Lebensmittelanalytik und trotz des Fortschritts in der instrumentellen Analytik fester Bestandteil in jedem Labor. Seit einiger Zeit sind für den Aufschluss Infrarotgeräte im Handel. Aber sind diese auch genauer oder schneller als konventionelle Aufschlussgeräte? Dieser Frage ging eine Bachelorarbeit an der Hochschule Bremerhaven nach.</p>
<p>Beim klassischen Blockaufschluss, zum Beispiel mit dem Foodalyt SBS 800 (Omnilab), überträgt ein Aluminiumheizblock die Wärme im direkten Kontakt auf die Probengefäße. Der Heizblock wird je nach Anwendung auf etwa 400 °C erhitzt. Bis die Probe diese Zieltemperatur erreicht, vergehen etwa 40 Minuten. Die Abkühlung des Metallblocks unter 100 °C durch Abgabe von Wärme an die Umgebung kann mehrere Stunden dauern. Im Gegensatz dazu erhitzen im Food-alyt IR 1200P Quarz-Infrarotstrahler die Proben unmittelbar. Diese Quarzstrahler arbeiten mit einem Wellenlängenbereich von 780 bis 1100 nm und erhitzen die Probe innerhalb einer Minute auf über 800 °C. Da keine signifikante Masse erhitzt wird, ist keine Abkühlphase nötig, um das Gerät für weitere Aufschlüsse zu verwenden.</p>
<p>Die unterschiedliche Arbeitsweise der beiden Geräte zeigt die Abbildung.</p>


<h2>Material und Methode</h2>
<p>Am Beispiel Haferflocken wurden jeweils drei Aufschlussmethoden für konventionelle und Infrarot-Aufschlusssysteme miteinander verglichen. Hierzu wurden Kjeltabs Typ CT von Omnilab verwendet, die 5,0 g Kaliumsulfat, 0,15 g Kupfer(II)sulfatpentahydrat und 0,15 g Titandioxid enthalten. Die anschließenden Wasserdampfdestillationen und Titrationen blieben unverändert. Die jeweiligen Temperaturprogramme der Aufschlüsse und die Ergebnisse der Kjeldahl-Bestimmungen stehen in der Tabelle (S. 902).</p>


<h2>Ergebnisse</h2>
<p>Mit konventionellem Aufschluss und mit Infrarotaufschluss lassen sich übereinstimmende Stickstoffgehalte erzielen. Allerdings ergeben sich unterschiedliche Aufschlusszeiten. Während die Infrarotgeräte konstante Stickstoffwerte und Reaktionszeiten erzielten, zeigen die Aufschlüsse mit dem konventionellen Blocksystem starke zeitliche Schwankungen und variierende Konzentrationen.</p>
<p>Ursache für die Abweichungen ist die komplexe Probenmatrix; sie bringt die Aufschlusslösung zum Schäumen. Dies kann nicht nur zu Verlusten durch Anhaften von Probenresten an den oberen Teilen des Gefäßes führen, sondern auch den Aufschluss durch schlechtere Wärmeübertragung verzögern. Daher ist bei allen Aufschlüssen ein Mittelweg zwischen moderatem Schäumen und kurzer Aufschlusszeit anzustreben.</p>
<p>Bei Aufschluss 1 mit einer schonenden Erhitzung schäumt die Lösung überhaupt nicht, allerdings ist die Aufschlusszeit inakzeptabel lang. Die schonende Erhitzung führt auch nicht zu einer präziseren Bestimmung — im Gegenteil, die relative Standardabweichung ist die zweithöchste der hier durchgeführten Aufschlüsse.</p>
<p>Eine massive, konventionelle Wärmezufuhr (Aufschluss 2) führt zwar zu einer sehr kurzen Aufschlusszeit, aber auch zu der höchsten relativen Standardabweichung. Bei beiden Aufschlüssen (1 und 2) waren die Werte für die Stickstoffkonzentration niedriger als bei den anderen vier Aufschlüssen. Das beste Verhältnis zwischen Aufschlusszeit und relativer Standardabweichung erreichte der konventionelle Aufschluss 3 mit 75 Minuten und 0,53 % Abweichung.</p>
<p>Alle getesteten Infrarotaufschlüsse unterschieden sich nicht in der Reaktionszeit, sie lag bei 90 Minuten. Zudem reduzierte schonende Energiezufuhr am Anfang das Schäumen auf ein Minimum (Aufschluss 6). Dieser Versuch wies auch die geringste relative Standardabweichung auf. Die weiteren Infrarotaufschlüsse ergaben ebenfalls akzeptable Standardabweichungen (Aufschlüsse 4 und 5).</p>


<h2>Fazit</h2>
<p>Trotz der jahrzehntelangen Erfahrung mit der Bestimmung nach Kjeldahl bieten sich immer noch Möglichkeiten, den Aufschluss zu optimieren. Abhängig vom Probenmaterial und der jeweiligen Tendenz zum Schäumen, sinkt durch angepasste Aufschlussbedingungen die Analysenzeit.</p>
<p> Unter idealen Aufschlussbedingungen war mit einem konventionellen Blocksystem die Versuchszeit gegenüber dem Infrarotgerät um 15 Minuten kürzer (Aufschluss 3 im Vergleich zu den Aufschlüssen 4 bis 6). Diese Zeitersparnis relativiert sich durch die lange Abkühlphase.</p>
<p>Der Ablauf des Aufschlusses beeinflusst auch Präzision und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. So kommt es bei langsamem Erhitzen der Proben in kleinen Schritten bei beiden Verfahren zu den geringsten relativen Standardabweichungen mit maximalem Proteingehalt ergaben (Aufschluss 3 und 6). Der Vorzug liegt hier beim Infrarotaufschluss, da die Proben deutlich weniger schäumten.</p>
<p>Zur Auswahl des Aufschlussgeräts sind neben der Aufschlusszeit immer die relative Standardabweichung sowie der höchste Wert der Analyse wichtige Kenndaten. Ebenso ist zu berücksichtigen, wie häufig Aufschlüsse durchgeführt werden, etwa ob nur ein Aufschluss pro Tag erforderlich ist oder das Geräte für mehrere Durchläufe benötigt wird. Ein Infrarot-Aufschlussgerät ist sofort wieder für den nächsten Aufschluss einsatzbereit, während ein konventioneller Aufschlussblock Stunden zum Abkühlen auf die Ausgangstemperatur benötigt. Daher eignet sich für mehrere Aufschlüsse am Tag das Infrarotgerät.</p>
<p>Hauke Hilz, Jahrgang 1977, studierte Lebensmittelchemie an der Universität Hamburg und promovierte 2007 an der Universität Wageningen. Danach arbeitete er als Arbeitsgruppenleiter am ttz Bremerhaven. Seit dem Jahr 2010 ist er Professor für Lebensmittelchemie an der Hochschule Bremerhaven. Annika Eilers, Jahrgang 1988, ist Bachelorstudentin der Lebensmitteltechnologie an der Hochschule Bremerhaven. Gunda Märkle, Jahrgang 1961, studierte Lebensmitteltechnologie an der Hochschule Bremerhaven. Im Anschluss arbeitete sie als Laboringenieurin im Institut für Fischqualität in Bremerhaven. Seit 2004 ist sie als Technische Angestellte im Labor für Lebensmittelchemie an der Hochschule Bremerhaven tätig. Claus Beninga, Jahrgang 1967, studierte Chemie an der Universität Göttingen und promovierte dort 1998. Nach mehrjähriger Tätigkeit in Forschung und Industrie leitet er heute die Omnilab Analysen Systeme. Eva-Maria Rieger, Jahrgang 1961, studierte Biologie an der Universität Bremen und arbeitete zunächst in Forschung und Industrie. Seit 2006 ist sie bei Omnilab tätig.</p>



Artikel

Aufschluss nach Kjeldahl: Infrarot oder konventionelle Erhitzung

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<p>In Deutschland regelt die Trinkwasserverordnung die Überwachung einer ganzen Reihe von Parametern. Hierzu zählen neben Indikatorparametern (Färbung, Geschmack, Kolonienzahl, elektrische Leitfähigkeit …) mikrobiologische (Enterokokken, coliforme Bakterien) und chemische Parameter. Neben in Wasser gelösten Metallen wie Cadmium, Blei, Chrom und Nickel sind anionische Bestandteile wie Bromat, Fluorid oder Nitrat zu analysieren sowie organische Verbindungen wie Benzol, Pflanzenschutzmittel und Biozide. Dazu kommt die Analyse weiterer organischer Verbindungen in Gewässern, die zwar nicht vorgeschrieben sind, die aber aus wissenschaftlichem Interesse durchgeführt werden.</p>
<p>Wasser fließt durch die Natur und transportiert dadurch gelöste organische Substanzen (CDOM; chromophoric dissolved organic matter), die aus verschiedenen Quellen kommen und zu denen daher unterschiedlichste chemische Verbindungen gehören. Die Konzentrationen der CDOM im Wasser und ihre chemische Zusammensetzung variieren dabei zum Beispiel je nach Ort und Zeit der Probennahme. Die ursprüngliche Zusammensetzung kann sich dabei ändern, da chemische und biologische Prozesse, etwa Fäulnis, das Verbindungsspektrum verändern.</p>
<p>Neben dem naturgegebenen Eintrag organischer Komponenten in aquatische Systeme spielt der Eintrag von organischen Komponenten durch den Menschen eine große Rolle. Wichtige Eintragsquellen sind die Landwirtschaft, die Industrie, die organische Chemikalien einsetzt, sowie Arzneimittelrückstände aus Kläranlagen. Dabei sind nicht nur Summenparameter gefragt, immer häufiger sind die Einzelkomponenten zu bestimmen.</p>


<h2>Analyse organischer Verbindungen</h2>
<p>Für die Analyse von organischen Verbindungen stehen eine Reihe von Techniken zur Verfügung. Im Normalfall liegt die zu untersuchende Verbindung nicht isoliert vor, sondern ist in eine Matrix aus einem Gemisch anorganischer und organischer Komponenten eingebunden. Daher erfolgt meistens erst eine Probenvorbereitung, die aus mehreren Schritten wie Elution, Festphasenanreicherung oder auch Derivatisierung bestehen kann. Auf diese Probenvorbereitungsschritte folgen oft chromatografische Techniken, in denen Gaschromatographie (GC) oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) die Stoffgemische trennen und die einzelnen Komponenten detektiert werden.</p>
<p> Eine weitere Technik, mit der organische Verbindungen analysiert werden können, ist die Fluoreszenzspektroskopie. Sie hat den Vorteil, dass sie keine chemischen Probenvorbereitungsschritte erfordert. Die Fluoreszenz eines Moleküls wird durch verschiedene Parameter charakterisiert. Hierzu zählen die spektrale Verteilung der emittierten Strahlung (Fluoreszenzspektrum), die Lebensdauer des fluoreszenzfähigen Zustands (Fluoreszenzlebensdauer) sowie das Verhältnis der emittierten Lichtquanten zu den absorbierten Lichtquanten (Fluoreszenzquantenausbeute).</p>


<h2>Absorption und Emission parallel messen</h2>
<p>Das Fluoreszenzspektrometer Aqualog von Horiba Scientific wurde speziell für die Analytik von Wasserproben entwickelt und für die schnelle Detektion der Anregungs-Emissions-Matrix (excitation emission matrix, EEM) ausgelegt. Das Emissionsspektrum nimmt dabei ein CCD-Detektor auf. Dieser erfasst einen Spektralbereich von 200 nm bis 630 nm und ist ca. 100 Mal schneller als etwa ein Photomultiplier. Neu ist, dass ein Transmissionsdetektor, eine Silicium-Photodiode, gleichzeitig das Absorptionsspektrum der Probe aufnimmt. Hierdurch können direkt Einflüsse wie der innere Filtereffekt, den die Probe verursacht, korrigiert werden. Die EEM erlaubt, mit einer multivariaten Datenanalyse, z. B. Parafac, organischer Komponenten in den Proben quantitativ und qualitativ zu bestimmen.</p>
<p>Neben der hohen Analysengeschwindigkeit zeichnet sich das Aqualog durch eine hohe Empfindlichkeit und damit durch niedrige Nachweisgrenzen aus. Die Messzeit für eine klassische EEM liegt bei etwa 1 Minute. Hierdurch lassen sich Proben im niedrigen Spurenbereich analysieren.</p>
<p>Das Signal-Rausch-Verhältnis ist mit 2000:1 spezifiziert, gemessen am Wasser-Ramansignal bei 350 nm Anregung, 397 nm Emission und 5 nm Bandpass. Eine spektrale Kalibrierung sowohl für den Emissions- als auch für den Transmissionsdetektor basiert auf Nist-Standards. Somit lassen sich die korrigierten Daten sofort mit anderen Messdaten vergleichen.</p>


<h2>Beispiel</h2>
<p>Das Beispiel einer typischen EEM aus einer Wasserprobe aus einem natürlichen Gezeitenfeuchtgebiet in Kalifornien zeigt Abbildung 1 (S. 903).</p>
<p>Diese EEM wurde in die entsprechenden Anregungs- und Emissionskomponenten zerlegt. Abbildung 2 zeigt das Beispiel für eine Parafac-Zerlegung einer EEM. Mit entsprechenden, vorher zu bestimmenden Standardkomponenten, ergibt sich eine grafische Darstellung mit den Stoffen, die in der Wasserprobe enthalten sind. Dabei beschreiben dreizehn separat erstellte Komponenten 98 % der Variabilität.</p>
<p>Die Parafac (parallele Factor Analysis) ist eine mulitvariate Datenanalyse, die komplexe Matrizen wie mit der Fluoreszenzspektroskopie aufgenommene EEMs in einzelne Bestandteile zerlegt. Dabei ist es entscheidend, durch entsprechende Untersuchungen eine Anzahl an Komponenten zu finden, die in dem geographischen Gebiet, in dem die Probe genommen wurde, charakteristisch für diese Art der Analysen ist. Diese Komponenten dienen als Standards zur Auswertung unbekannter Proben.</p>


<h2>Zusammenfassung</h2>
<p>Mit den Aqualog steht ein neues Fluoreszenzspektrometer zur Verfügung. Es ist universell für verschiedene Anwendungen in der Wasseranalytik einsetzbar. Da das Gerät gleichzeitig die Absorption misst und damit verbunden den inneren Filtereffekt schnell korrigiert, ist als Probenvorbereitung meistens nur eine Verdünnung erforderlich. Optional erhältliches Zubehör wie temperierbare Küvettenhalter oder ein Autosampler erweitern den Anwendungsbereich zum Beispiel auf Routineanalytik und Qualitätskontrolle. Durchflussküvetten machen auch eine Online-Charakterisierung an Wasserentnahmestellen möglich.</p>
<p>Rainer Nehm hat Chemie an der Universität Dortmund studiert und in analytischer Chemie promoviert. Seit dem Jahr 1998 betreut er ein Applikationslabor bei Horiba Scientific. <a href="mailto:rainer.nehm@horiba.com">rainer.nehm@horiba.com</a> Frank Birke hat in Leipzig Physik studiert und ist seit 21 Jahren im Vertrieb für die Fluoreszenzproduktlinie bei Horiba Scientific tätig.</p>


<p>Die Autoren danken Brian Bergamaschi, U.S. Geological Survey, sowie Adam Gilmore, U.S. Horiba Scientific, für die freundliche Unterstützung.</p>


<h2>Endokrin wirksame organische Spurenstoffe in Wasser</h2>
<p>Die Kontaminationsmöglichkeiten von Gewässern mit gelösten organischen Substanzen (CDOMs) und deren wirkungsvolle Entfernung aus dem Wasser werden derzeit in einer Reihe von wissenschaftlichen Projekten untersucht (darunter das europäische Exzellenzprojekt Athene, das Verbundprojekt TransRisk, das EU-Projekt Pills). Dies liegt vor allem daran, dass organische Verbindungen endokrin (Chlofibrinsäure, Endosulfan, Dieldrin, Chlordan), androgen (Tributylzinnverbindungen, Linuron, Diuron, 3,4-Dichloranilin (3,4-DCA)) oder karzinogen (N-Nitrosamine, Aflatoxine, Azoverbindungen) wirken können. Gerade bei den hormonell wirksamen organischen Substanzen sind negative Auswirkungen auf im Wasser lebende Tiere wie Fische, Seesterne, Schnecken, aber auch Amphibien und Reptilien bekannt. So wurde im englischen Fluss Aire bei Leeds beobachtet, dass männliche Regenbogenforellen Vitellogenin bildeten. Dies ist ein Eiweißstoff, den weibliche Tiere während der Entwicklung bilden und für die spätere Bildung des Rogens speichern. Das Gen zur Steuerung der Vitellogeninproduktion ist zwar auch bei männlichen Tieren vorhanden, wird aber nur durch Östrogene und östrogen wirksame Substanzen angeregt. Die Bildung des Vitellogenin bei männlichen Regenbogenforellen im Aire wurde auf Alkylphenole zurückgeführt, die vermutlich mit dem Abwasser der nahe gelegenen Textilindustrie in den Fluss gelangten.</p>



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