Wissenschaft & Forschung

<p>Kurz notiert</p><h2>Neuronale Netzwerke mit Licht reparieren</h2><p>Nervenzellen lassen sich durch Licht reparieren. Dies zeigen Wissenschaftler des Helmholtz-Zentrums München am Lateralisnerv von Zebrafischen. Die Forscher verwendeten dafür eine Form des Enzyms Adenylatzyklase, die durch blaues Licht aktivierbar ist und cAMP bildet. Die Wissenschaftler untersuchen nun, ob sich das Konzept auf komplexere Nervenbahnen übertragen lässt und in höheren Tieren funktioniert. HR</p><ul><li>
<sup>1 </sup>Current Biology 2015, doi: 10.1016/j.cub.2015.09.038</li></ul>
<h2>Liposome als Wirkstoffträger bei verengten Blutgefäßen</h2><p>Künstliche Phospholipidvesikel eignen sich potenziell als Wirkstoffträger. In Studien der Universitäten Basel und Fribourg lösten sie auch in hohen Dosen bei Schweinen keine Immunreaktion aus. An verengten Gefäßstellen ist die Scherspannung erhöht, und das Blut fließt schneller. Das Liposom öffnet sich unter diesen Bedingungen und gibt seinen Inhalt frei. NK</p><ul><li>
<sup>2 </sup>Nanomedicine: NBM 2016, doi: 10.1016/j.nano.2015. 12.364</li></ul>


Meldung

Wissenschaft und Forschung: Kurz notiert

Kurz notiertNeuronale Netzwerke mit Licht reparierenNervenzellen lassen sich durch Licht reparieren. Dies zeigen Wissenschaftler des Helmholtz-Zentrums München am Lateralisnerv von Zebrafischen. Die Forscher verwendeten dafür eine Form des Enzyms Adenylatzyklase, die durch blaues Licht aktivierba...

<p>Cyclische Peptide natürlichen Ursprungs dienen seit Jahren als Medikamente. Aber nicht gegen alle Krankheiten hält die Natur Peptide bereit. Neue Methoden erlauben es nun, cyclische Peptide gegen beliebige Zielproteine aus großen kombinatorischen Bibliotheken zu isolieren.</p>
<p>Cyclische Peptide sind Moleküle, deren ursprünglich lineare Aminosäurekette kovalent zu einem oder mehreren Ringen geschlossen ist. Das Molekül cyclisiert entweder über eine Peptidbindung zwischen N- und C-Terminus oder über die Aminosäureseitenketten, etwa durch eine Disulfidbrücke. Die Eigenschaften der cyclischen Peptide prädestinieren sie als Therapeutika: Neben einer hohen Bindungsaffinität für Zielproteine haben sie eine hohe Bindungsspezifität, sind stabil und meist nur wenig toxisch. Außerdem lassen sie sich chemisch einfach synthetisieren.</p><p>Zu einem wesentlichen Teil basieren diese Eigenschaften auf der Struktur: Die eingeschränkt flexible Konformation reduziert den Entropieverlust während der Bindung an das Zielprotein und führt somit zu einer stärkeren Bindung. Außerdem erhöht die beschränkte Zahl an möglichen Konformationen die Bindungsspezifität für das Zielprotein.</p><p>Ein weiterer Effekt, der für die therapeutische Nutzung entscheidend ist, ist die proteolytische Stabilität: Sie ist höher als bei linearen Peptiden. Die starre Konformation der cyclischen Peptide behindert das Binden in der katalytischen Tasche der Proteasen und somit den Abbau durch diese.</p><h2>Wirkstoffe aus der Natur</h2><p>Viele bioaktive cyclische Peptide natürlichen Ursprungs dienen in ursprünglicher oder modifizierter Form als Therapeutika: etwa die Antibiotika Vancomycin, Daptomycin und Polymyxin B, die Hormone oder die Hormonanaloga Oxytocin, Vasopressin und Ocreotid sowie das Immunsuppressivum Ciclosporin. Ciclosporin, Ocreotid und Daptomycin gehören zu den 200 umsatzstärksten Medikamenten in den USA.<sup>1)</sup></p><p>Das therapeutische Potenzial cyclischer Peptide ist bei weitem nicht ausgeschöpft. Ein Grund dafür ist die beschränkte Verfügbarkeit cyclischer Peptidliganden; die Natur bietet nicht für alle Zielproteine cyclische Peptide. Wissenschaftler fragen sich deshalb, wie man synthetische cyclische Peptidliganden entwerfen könnte. Die Strategien dazu lassen sich grob in zwei Herangehensweisen unterteilen: rationales Design und Fischen bioaktiver Liganden aus großen kombinatorischen Peptidbibliotheken.</p><h2>Rationales Design</h2><p>Für viele Zielproteine sind Protein- oder Peptidliganden bekannt, die sich als Vorlage für cyclische Peptidliganden eignen. Bei linearen Peptiden wird die Aminosäuresequenz beibehalten, und die N- und C-Enden der Peptide oder die Seitenketten endständiger Aminosäuren werden verbunden.</p><p>Bei Proteinen werden die Aminosäuresequenzen, die mit dem Zielprotein interagieren, als Peptidsequenz nachgebildet und mit chemischen Reaktionen cyclisiert. Beispielsweise wurden β-Stränge von Proteinen als Vorlage verwendet und als synthetische Peptide so cyclisiert, dass deren Konformation erhalten blieb.<sup>2)</sup> Basierend auf dem gleichen Prinzip wurden α-Helices aus Bindungsregionen von Proteinen als Peptide synthetisiert und deren α-helikale Konformation durch chemische Brücken stabilisiert.<sup>3)</sup> Diese und ähnliche Designstrategien lieferten hochaffine cyclische Peptidliganden, von denen einige in klinischen Studien als Therapeutika getestet werden. Beispiele sind das antibakterielle β-Strang-Peptid POL7080 und das p53-reaktivierende, gestapelte Peptid ALRN-6924.</p><h2>Aus kombinatorischen Bibliotheken</h2><p>Eine weitere wichtige Strategie, um Peptidliganden zu entwickeln, basiert darauf, bioaktive Liganden in kombinatorischen Peptidbibliotheken zu identifizieren. Dafür wird eine große Anzahl cyclischer Peptide mit zufälligen Aminosäuresequenzen synthetisiert und anschließend mit Hochdurchsatzmethoden getestet. Eine Methode, cyclische Peptidbibliotheken herzustellen, basiert auf der Split-and-pool-Strategie, bei der mit geringem Aufwand viele verschiedene Peptide synthetisiert werden. Neuere Ausführungen dieser Strategie codieren die cyclischen Peptide mit synthetischer DNA.<sup>4)</sup> Andere Ansätze nutzen programmierte Pipettierroboter, welche die cyclischen Peptide auf individuellen Feldern einer Oberfläche synthetisieren; anschließend testen sie mit fluoreszenzmarkierten Proteinen, ob sie binden.</p><h2>Bioaktive Peptide mit In-vitro-Display-Techniken identifizieren</h2><p>Die kombinatorische Synthese macht theoretisch Peptidbibliotheken mit sehr hoher Diversität zugänglich. Besteht ein cyclisches Peptid aus 6 Aminosäuren, ließen sich mit den 20 natürlichen Aminosäuren theoretisch 20<sup>6</sup>, also 64 Millionen verschiedene Peptide herstellen. Diese Zahl erhöht sich bei einem Peptid aus 9 Aminosäuren auf 512 Milliarden. In der Praxis werden jedoch mit diesen Methoden meist weniger als eine Million verschiedener cyclischer Peptide hergestellt und getestet.</p><p>Die Phage-Display-Methode (Kasten S. 14) ermöglicht, Peptidliganden aus sehr großen Peptidbibliotheken zu identifizieren.<sup>5)</sup> Bei Phage-Display werden künstliche Peptide oder Proteine auf der Oberfläche von Bakteriophagen verankert. Die Peptid- oder Protein-DNA ist im Bakteriophagengenom integriert und wird dadurch im Phagenpartikel verpackt. Mit der Methode lassen sich Milliarden verschiedener Peptide oder Proteine genetisch codieren. Peptide oder Proteine, die an ein immobilisiertes Zielprotein binden, werden anschließend aus der Bibliothek geangelt und durch DNA-Sequenzierung identifiziert.</p><p>Um cyclische Peptidliganden mit Phage-Display zu entwickeln, werden die codierten Peptide mit zwei Cysteinen flankiert, die auf den Phagen eine Disulfidbrücke bilden und dadurch cyclisieren (Abbildung 1A, S. 11).<sup>6)</sup> Neben Phage-Display gibt es viele andere Methoden, um Peptide oder Proteine an deren codierende DNA zu koppeln. Dazu gehören mRNA-Display, Ribosom-Display, Hefen-Display und Bakterien-Display. Wissenschaftler nutzen neben Phage-Display insbesondere mRNA-Display für die In-vitro-Evolution cyclischer Peptidliganden.<sup>7)</sup> Bei dieser Methode knüpfen Peptide oder Proteine während des Translationsprozesses kovalent an die codierende mRNA (Abbildung 1B).</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/gjUnPBjSfqwS7Qx21X5C"><figcaption><label>Abb. 1: </label>Genetisch codierte cyclische Peptide. A) Ein Peptid mit zwei Cysteinen ist auf einem Phagen verankert und wird durch Oxidation cyclisiert. B) Ein Peptid ist via Puromycin (Pu) an mRNA gekoppelt und wird durch Reaktion einer unnatürlichen Aminosäure mit Cystein cyclisiert.</figcaption></figure>
<h2>Wie funktioniert Phage-Display?</h2><p>Bei der Phage-Display-Methode werden viele, meist Milliarden verschiedene Peptide oder Proteine mit deren codierender DNA gekoppelt. Dadurch ergibt sich eine große, genetisch codierte Substanzbibliothek. Peptide oder Proteine, die anschließend an ein Zielprotein binden, werden über die Affinität aus der Bibliothek isoliert („gefischt“, Abbildung A). Der DNA-Code erlaubt, anschließend die Aminosäuresequenz durch DNA-Sequenzierung zu bestimmen. Die Kopplung von Peptid (oder Protein) und DNA gelingt, indem deren DNA in das Genom eines Bakteriophagen an das Gen eines Phagen-Mantelproteins angefügt wird, zum Beispiel dem p3 (Abbildung B).<sup>5)</sup> Gelangt die veränderte Phagen-DNA in Bakterien, produzieren die Phagen Peptid-p3-Fusionsproteine, die sich zur Herstellung neuer Phagen eignen. Dadurch wird das Peptid auf der Oberfläche der Phagen verankert, während die codierende DNA zusammen mit dem Phagen-Genom im Phagen verpackt wird. Mit dieser Methode wurden peptid- und proteinbasierende Liganden sowie Antikörper hergestellt. Mehrere durch Phage-Display hergestellte humane Antikörper wie der TNFa-Blocker Adalimumab sind äußerst erfolgreiche Medikamente.<sup>12)</sup></p><h2>Mit unnatürlichen Aminosäuren</h2><p>Bei den vorgestellten In-vitro-Display-Methoden synthetisieren Ribosomen die von DNA oder mRNA codierten kombinatorischen Peptidbibliotheken. Da Ribosomen natürlicherweise Aminosäuren als Bausteine verwenden, sind alle aus diesen Methoden hervorgehenden Liganden Peptide oder Proteine. Verschiedene Strategien erweitern die chemische Diversität der Bibliotheken. Eine besteht darin, genetisch codierte Peptide oder Proteine in chemischen oder enzymatischen Reaktionen zu modifizieren.<sup>8)</sup></p><p>Andere Strategien basieren auf unnatürlichen Aminosäuren: Ribosomen können diese verarbeiten, wenn sie sich strukturell nicht zu stark von den natürlichen Aminosäuren unterscheiden. mRNA-Display hat sich dabei besonders bewährt, da hierbei die Synthese in vitro in einem Zellextrakt abläuft, dem sich vorgefertigte Aminosäure-tRNA-Konjugate leicht zusetzen lassen.<sup>9)</sup> Auch N-methylierte Aminosäuren lassen sich in mRNA-Display-Bibliotheken einbauen. Zur Cyclisierung mRNA-codierter Peptide wird neben den beschriebenen Strategien eine unnatürliche Aminosäure verwendet, das N<sup>a</sup>-(2-chloracetyl)-tryptophan. Hierbei reagiert die Chloracetylgruppe mit einer Cysteinseitenkette zu einer Thioetherbrücke (Abbildung 1B).</p><h2>Bicyclische Peptide</h2><p>Damit sie sich als Therapeutika eignen, sollten cyclische Peptide idealerweise mit einer pikomolaren Dissoziationskonstante binden. Viele Peptide, die mit Phage-Display und anderen Displaytechniken entwickelt wurden, haben jedoch keine solch hohe Bindungsaffinität.</p><p>Mit dem Ziel, hochaffine Peptidliganden herzustellen, haben wir eine Strategie entworfen, mit der sich bicyclische Peptide in vitro entwickeln lassen. Die bicyclischen Peptide bestehen aus zwei makrocyclischen Peptidringen (Abbildung 2, S. 13), die gleichzeitig an ein Zielprotein binden. Dadurch erhöhen sich die Bindungsaffinitäten.</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/1MWcuRa4QeO0BuSrMBQf"><figcaption><label>Abb. 2: </label>Bicyclische Peptide. A) Chemische Struktur, B) dreidimensionales Strukturmodell.</figcaption></figure>
<p>Bicyclische Peptide haben im Vergleich mit monocyclischen Peptiden ähnlicher Größe eine starrere Konformation, was sich positiv auf die proteolytische Stabilität auswirkt. Auch bicyclische Peptide lassen sich in vitro mit Phage-Display herstellen (Abbildung 3 S. 13): Zunächst werden Milliarden von verschiedenen linearen Peptiden, die jeweils drei Cysteine enthalten, auf Bakteriophagen verankert. Im zweiten Schritt werden die Peptide chemisch cyclisiert. Für diese Reaktion werden Moleküle verwendet, die drei thiolreaktive Gruppen enthalten und dadurch mit den Seitenketten der Cysteine reagieren.<sup>10)</sup> Im dritten Schritt werden die bicyclischen Peptide mit der gewünschten Spezifität aus der Phagenbibliothek gefischt, und deren Peptidsequenz wird durch DNA-Sequenzierung identifiziert.</p><figure><img src="https://media.graphcms.com/VN89PfTBQuaNz3nOqLNz"><figcaption><label>Abb. 3: </label>Phage-Display-Methode zur Herstellung bicyclischer Peptidliganden.</figcaption></figure>
<p>Mit dieser Strategie entstanden diverse bicyclische Peptide als Liganden: sowohl für Proteasen wie Plasmakallikrein, Urokinase, Cathepsin G und Faktor XII als auch für Rezeptoren wie Her2 und Notch1. Alle haben Bindungsaffinitäten im nano- oder pikomolaren Bereich. Bei den Proteasen wurden funktionelle Liganden identifiziert, die im aktiven Zentrum der Proteasen binden und deren Aktivität inhibieren (Abbildung 4).<sup>11)</sup></p><figure><img src="https://media.graphcms.com/OEavjsbRTidfxHtUwbdL"><figcaption><label>Abb. 4: </label>Kristallstrukturen dreier bicyclischer Peptide, die durch Phage-Display gegen Urokinase isoliert wurden. Die drei Peptide mit verschiedenen Peptidsequenzen (in verschiedenen Farben) und chemischen Linker (rot) binden alle an die katalytische Stelle der Urokinase (grau) und inhibieren deren proteolytische Aktivität.</figcaption></figure>
<p>Eine gemeinsame Eigenschaft der mit Phage-Display entwickelten bicyclischen Peptide ist deren hohe Bindungsspezifität für die Zielproteine. Die meisten der bicyclischen Peptide waren in In-vivo-Studien sehr stabil. Konjugation dieser Peptide an Albuminbinder wie Fettsäuren verhinderte, dass die Niere die Substanz zu schnell aus dem Körper entfernte. So wurde eine lange Exposition erreicht. Erste pharmakologische Studien an Tieren laufen.</p><h2>Perspektiven</h2><p>Die neuen Techniken ermöglichen, synthetische Peptidliganden für beinahe jedes beliebige Zielprotein zu entwickeln. Dieser Fortschritt hat der Peptidforschung einen Schub verliehen: Viele Unternehmen, darunter Start-ups und etablierte Pharmafirmen, nutzen diese Methoden. Es ist möglich, dass schon bald erste cyclische Peptide aus der In-vitro-Evolution in der Medizin eingesetzt werden.</p><h2>Quergelesen</h2><p>Cyclische Peptide eignen sich aufgrund ihrer guten Bindungseigenschaften, um daraus Medikamente zu entwickeln.</p><p>Indem die Aminosäuresequenz angepasst wird, können cyclische Peptide mit hoher Affinität und Spezifität an beliebige Zielproteine binden.</p><p>Methoden wie Phage-Display oder mRNA-Display erlauben, Liganden aus Bibliotheken von Milliarden cyclischer Peptide zu isolieren.</p><p>Christian Heinis ist Associate Professor an der Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Seine Arbeitsgruppe beschäftigt sich mit der Entwicklung von neuen Methoden zur Herstellung von Medikamenten, die auf makrocyclischen Molekülen basieren. <email><a href="mailto:christian.heinis@epfl.ch">christian.heinis@epfl.ch</a></email></p><div><img src="https://media.graphcms.com/1jztf8fzT2Gc6pViwuPV">

</div><p></p><p>Christina Lamers studierte von 2004 bis 2008 Pharmazie an der Universität Frankfurt am Main und promovierte dort von 2010 bis 2014 in pharmazeutischer Chemie bei Manfred Schubert-Zsilavecz. Seit August 2015 ist sie Postdoc im Labor von Christian Heinis für therapeutische Proteine und Peptide.</p><div><img src="https://media.graphcms.com/Aq3rxYSwTkyaw1hcIVvg">

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<ul><h2>Literatur</h2><li>
<sup>1 </sup>E. Vitaku, E. A. Ilardi, J. T. Njarðarson (2013): Top 200 Pharmaceutical Products by US Retail Sales in 2012.</li><li>
<sup>2 </sup>J. A. Robinson, S. DeMarco, F. Gombert et al., Drug Discov Today 2008, 13, 944.</li><li>
<sup>3 </sup>P. M. Cromm, J. Spiegel, T. N. Grossmann, ACS Chem. Biol. 2015, 10, 1362.</li><li>
<sup>4 </sup>Z. J. Gartner, B. N. Tse, R. Grubina et al., Science 2004, 305, 1601.</li><li>
<sup>5 </sup>G. P. Smith, Science 1985, 228, 1315.</li><li>
<sup>6 </sup>S. Chen, C. Heinis (2013): Phage selection of mono- and bicyclic peptide ligands in Biotherapeutics – Recent developments using chemical and molecular biology (Hrsg. L. H. Jones, A. J. McKnight), RSC.</li><li>
<sup>7 </sup>R. W. Roberts, J. W. Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997, 94, 12297.</li><li>
<sup>8 </sup>C. Heinis, G. Winter, Curr. Opin. Chem. Biol. 2015, 26, 89.</li><li>
<sup>9 </sup>C. J. Hipolito, H. Suga, Curr. Opin. Chem. Biol. 2012, 16, 196.</li><li>
<sup>10 </sup>S. Y. Chen, D. Bertoldo, A. Angelini et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 1602.</li><li>
<sup>11 </sup>A. Angelini, L. Cendron, S. Y. Chen et al., ACS Chem. Biol. 2012, 7, 817.</li><li>
<sup>12 </sup>A. E. Nixon, D. J. Sexton, R.C. Ladner, Mabs-Austin 2014, 6, 73.</li></ul>


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